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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNA电泳
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)

[求助] RNA电泳

各位，我的RNA电泳结果很差，是降解了吗？（最左边是生工的100bp DNA ladder）我是刚提完就跑的电泳，是提取过程中操作不当吗？

RNA电泳
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1楼 2012-03-12 10:20:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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26楼2012-03-15 14:24:15
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by karin at 2012-03-12 17:08:26:
跑电泳的东西也是要处理的。我以前是用试剂盒提取的，所用的管子和枪头也都是买的去RNase的，把制胶的模具和电泳槽用DEPC处理，提取过程尽量迅速，效果还是不错的。你是提取的甚么的RNA呢？
    祝实验成功！

我是提取的反应器里的泥，跑电泳的槽子以及制胶的容器和板都没有用DEPC处理，我们一个老师说如果只是大概的看一下RNA质量不用那么麻烦，所以我就没处理了。但也不至于降解的这么快吧？
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7楼2012-03-12 20:03:30
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据我实验的经验，已经放弃RNA电泳了，每次都要换新的电泳液，清洗电泳槽，还得高电压。直接逆转录，P个内参跑电泳，直接检测cDNA质量。或许提取的RNA质量很好，只是电泳过程降解了呢。
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也许似乎大概是，然而未必不见得。
11楼2012-03-13 12:14:33
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lilyjimei

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mahoumeimei(金币+2): 2012-03-14 17:10:19
我之前大量提RNA，最重要的就是要避免RNA降解！你的条带很不清晰而且未分条带，可能原因：1.取的组织少或水溶解过多，导致RNA量太少；2.理论上可以不用跑Marker滴，但从你的Marker看也不太清晰而各条带未分开，可能是胶问题、跑胶时间也短了些；3.从源头上分析，可能样品也已经有些降解！改善实验条件多做几次，熟悉过程，自然速度就快了！~~加油~
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12楼2012-03-13 20:02:08
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chenhuize

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.排除实验中可能造成的污染，特别是电泳槽一定要用DEPC处理。
2.电泳之前测一下OD230OD260
3.电压调大，180V   10min就号
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13楼2012-03-14 00:12:37
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
预处理很重要，操作过程尽量快，其他的楼上均有说明，其实RNA降解的不是那么快，但是你的提取材料的确不是太好提的，你可以多做，大量做
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关关雎鸠，在河之洲
14楼2012-03-14 09:03:34
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
跑电泳的槽子什么的完全不用处理！
跑不出来不能怪槽子。
我跑RNA从来不处理槽子的，最多换换新的缓冲液，有时缓冲液也不换，该跑好的时候还是好的
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15楼2012-03-14 09:16:38
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-03-13 12:14:33:
根据我实验的经验，已经放弃RNA电泳了，每次都要换新的电泳液，清洗电泳槽，还得高电压。直接逆转录，P个内参跑电泳，直接检测cDNA质量。或许提取的RNA质量很好，只是电泳过程降解了呢。

我之前也是嫌处理槽子麻烦，所以就直接逆转录，再对cDNA进行PCR检测。但后来我们老师说好的RNA质量是做逆转录及后面一系列实验的必需条件，而且如果只是简单的看一下RNA质量不需要那么麻烦的处理电泳槽。
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20楼2012-03-14 17:14:14
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忆-雪

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-03-15 13:33:04
1：你可以买RNase-free的枪头，EP管，或者自己用0.1%DEPC水浸泡普通的枪头，然后高压处理后使用（我每次使用前高压3次）；
2：玻璃制品要清洗干净后，再用双蒸水清洗2-3遍，然后在180度烘烤至少6小时，烘烤前塑料盖子不能放进去，所有瓶子的瓶口要用锡箔纸盖好；
3.提取RNA时你的所有试剂，用品都要在一个干净的环境中进行，建议在超净台里操作，离心前离心机要提前打开，所有操作都要勤换手套，带口罩；
4。电泳使用的电泳槽、梳子，制胶板等要用3%的双氧水处理至少半小时或用0.5%的氢氧化钠溶液浸泡过夜，然后用高压后的0.1%DEPC水清洗干净再用；
5.所有试液的配制要全部使用高压后的0.1%的DEPC水溶液配制。
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23楼2012-03-15 12:38:44
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lilyjimei

新虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by mahoumeimei at 2012-03-14 17:08:55:
是的，因为是厌氧菌，长的特别慢，所以biomass很少，又不能取太多样，怕影响反应器运行。你说marker不清晰条带未分开可能是胶的问题，是说我的胶浓度不合适还是其它什么原因？

是的，marker不清晰条带未分开可能就是胶浓度问题（我的是1-1.5%）或胶跑的时间短了些~~另外拍照的也可以调下试试~~
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25楼2012-03-15 13:32:52
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
跑RNA最得小心了，实验过程中用到的试剂都要是无RNase的，枪头，电泳液，电泳槽，板子什么的都要处理好，不然的话降解很快而且很严重的哦
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27楼2012-03-15 14:33:58
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 回帖置顶 2012-03-15 21:56:45
西瓜: 金币+1, 给楼主参考~ 2012-03-15 21:57:07
无图无真相
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
28楼2012-03-15 16:40:27
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by mahoumeimei at 2012-03-14 17:14:14:
我之前也是嫌处理槽子麻烦，所以就直接逆转录，再对cDNA进行PCR检测。但后来我们老师说好的RNA质量是做逆转录及后面一系列实验的必需条件，而且如果只是简单的看一下RNA质量不需要那么麻烦的处理电泳槽。

如果条件允许，你就收拾一套电泳用具，专门跑RNA使用（我们都是共用达不到这个要求），而且用250V跑5Min 试试 再不行就跑变性电泳吧  试剂的话国产公司都有得卖
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也许似乎大概是，然而未必不见得。
29楼2012-03-15 21:07:24
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-03-15 21:09:33:
图不用说，很帅，最下面颜色暗暗的，能否解释一下什么情况么

我提得是原核细菌的total RNA，用来进行RNA-seq，对RNA的质量要求较高，RIN值要求比较严格。如果是普通的反转录调取基因，只要能扩增出来即可（但一定要注意消化DNA）。

我用的是普通跑DNA电泳的设备，500伏跑了不到10分钟。前面较暗的条带是loading buffer中的溴酚蓝。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
32楼2012-03-16 08:32:14
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普通回帖

karin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mahoumeimei(金币+2): 2012-03-12 20:05:20
你提取的RNA量太低而且降解严重。正常RNA电泳应该有28s、18s、5s三条带，28s的带的亮度约是18s带的两倍，最低也得等同，一般提取情况下5s的带很少见。你的RNA基本都降解了，建议认真彻底处理提取用具及环境！
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坚持就是胜利
2楼2012-03-12 12:29:14
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by karin at 2012-03-12 12:29:14:
你提取的RNA量太低而且降解严重。正常RNA电泳应该有28s、18s、5s三条带，28s的带的亮度约是18s带的两倍，最低也得等同，一般提取情况下5s的带很少见。你的RNA基本都降解了，建议认真彻底处理提取用具及环境！

我提取用的枪头是买的一次性的，实验台和移液枪都喷了酒精了，实验过程中都带着口罩和干净手套，求教还有哪里可能没注意到啊？急！急！急！
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3楼2012-03-12 15:00:57
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karin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木(金币+2): 鼓励 2012-03-13 10:30:25
mahoumeimei: 金币+1 2012-03-27 11:28:42
引用回帖:
3楼: Originally posted by mahoumeimei at 2012-03-12 15:00:57:
我提取用的枪头是买的一次性的，实验台和移液枪都喷了酒精了，实验过程中都带着口罩和干净手套，求教还有哪里可能没注意到啊？急！急！急！

跑电泳的东西也是要处理的。我以前是用试剂盒提取的，所用的管子和枪头也都是买的去RNase的，把制胶的模具和电泳槽用DEPC处理，提取过程尽量迅速，效果还是不错的。你是提取的甚么的RNA呢？
    祝实验成功！
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坚持就是胜利
4楼2012-03-12 17:08:26
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
mahoumeimei(金币+1): 2012-03-12 20:05:29
首先要说的是，RNA变性胶加入DNA marker没有意义，标记不了什么。从你的电泳图看，应该是有降解，好像电泳效果也不好，不知道电泳过程有没有问题。建议先测一下RNA质量，OD260和OD280之类的。祝好运！
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5楼2012-03-12 18:04:13
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a731705125

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mahoumeimei(金币+1): 2012-03-12 20:05:42
小丹木木(金币+5): 鼓励应助 2012-03-13 10:30:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by mahoumeimei at 2012-03-12 15:00:57:
我提取用的枪头是买的一次性的，实验台和移液枪都喷了酒精了，实验过程中都带着口罩和干净手套，求教还有哪里可能没注意到啊？急！急！急！

转自生物秀http://www.bbioo.com/experiment/13-1223-1.html
1、RNase 是RNA制备的杀手
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。
2、塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(a)塑料制品：尽可能使用无菌，一次性塑料制品。已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理方法如下：
(1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
(3)在通风柜中室温处理过夜。
(4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
(5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。
(b)玻璃和金属物品
250°C烘烤3小时以上。
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6楼2012-03-12 18:55:20
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by joan198108 at 2012-03-12 18:04:13:
首先要说的是，RNA变性胶加入DNA marker没有意义，标记不了什么。从你的电泳图看，应该是有降解，好像电泳效果也不好，不知道电泳过程有没有问题。建议先测一下RNA质量，OD260和OD280之类的。祝好运！

我跑的是琼脂糖胶
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8楼2012-03-12 20:04:55
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紫菱Kitty

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励交流经验！ 2012-03-14 22:29:15
降解得相当严重啊。操作要迅速。还有，可能是你用的试剂太久了需要重新配。我以前碰到过这种情况，换了新的试剂就没事了。
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梦随风万里，几度洪辰来去。人面桃花长相忆。又是一年春华成秋碧，莫叹明月笑多情。
9楼2012-03-12 23:42:14
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励交流。RNA没提出来也是很可能的。 2012-03-14 22:29:58
mahoumeimei: 金币+1 2012-03-27 11:28:51
首先，环境样本里面的RNA抽提对于材料的预处理很重要，要确保能够分离完整的环境样品RNA
其次，几乎可以肯定，你的琼脂糖电泳里面含有大量的RNase，而且，一般大家都用的TAE/TBE，电泳时间太长了；100%降解！
第三，更清晰的条带需要用尿素胶或者甲醛胶。

Good luck~
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致良知
10楼2012-03-13 08:37:09
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