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土壤真菌PCR-DGGE中真菌ITS区引物的选择
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本人初涉分子，要做有关土壤中真菌总菌的PCR-DGGE方面的实验，查阅了一些文献，现有几个问题向大侠们请教。 1.查阅了一些文献，看到所用真菌ITS区的引物有多种：ITS1/ITS2;ITS1/ITS4;ITS4/ITS5;ITS1-F/ITS2;ITS1-F/ITS4等。弱弱的问一句，我该怎么选择引物，这些引物在应用中有什么区别？ 2.GC结构应放在上游还是下游，看文献中放在上游的也有，放在下游的也有，我该怎么选择？ 谢谢大家！ |
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 土壤真菌 | 土壤真菌 | 分子生物学 | 高通量测序 |
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6楼2012-04-05 21:24:04
老夏853
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【答案】应助回帖
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额呵呵 刚才发现你曾经给过我红花 然后才看到你 这个帖子 这个问题我来回答你吧，， 首先你要知道真菌引物ITS1，ITS4 扩增的是真菌核糖体间隔区its1区，5.8S，以及ITS2 区 长度大概在六七百bp吧， 而DGGE 适合分析的片段长度大概在500以内最好 所以不适于选取这一对引物来做DGGE, 第二，我们实验室做真菌多样性用的是18S V1 V2 区，有一对引物叫做GCfung 和NS1 的好像 你可以查查这对引物，有一篇日本人做的文章 较早了 比较了its 引物和18S 引物做土壤真菌多样性的DGGE 结果，最后得出结论18S 的多样性较高。当然 我也怀疑他用18S可能扩增到土壤里面动植物以及的DNA 当然多样性就高了。 其实我想是不是可以选取ITS1区 和ITS 2 区分别去做DGGE 这样片段变短了 而且特异性也较高，当然这是我的想法 ，我实验不做真菌这块。 另外 至于GC clam 加在上游还是下游，一般是在上游的5‘端。 DGGE 的方法目前算是比较落后的了 因为它能检测到的多样性并不是那么准确。如果条件允许 可以去做一点高通量测序来检测样品里面的真菌多样性。 最后了 可能对你遇到的其他问题一点补充。土壤DNA 杂质比较多。扩增的时候可能会很难，需要注意：DNA 不能反复冻融，最好能分小管保存，第二 扩增的时候可以加一点BSA 或者DMSO 或者吐温。 呵呵 我知道就这么些了 |
2楼2012-03-22 18:56:55
老夏853
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【答案】应助回帖
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哦 对 这篇是比较18S 的引物 Comparison of 18S rDNA primers for estimating fungal diversity in agricultural soils using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis ITS1-F/ITS2;ITS1-F/ITS4 这两对引物里面的ITS1-F 是针对真菌子囊菌类群设计的优化引物 也有一篇文献的 Design of a primer for ribosomal DNA internal transcribed spacer with enhanced specificity for ascomycetes |
3楼2012-03-22 19:01:34
4楼2012-03-29 10:35:58