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构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上已有1人参与
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连续做了两个多月的表达载体构建了，始终不成功，希望各位大侠给与指点，具体情况如下： 载体为pBI121,目的基因700bp左右（两端分别加有BamHI 和SacI酶切位点，连接在pmd18-simple上），用这两个酶分别对pBI121和目的基因进行双酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），电泳检测（酶切完全）并回收，回收后电泳检测条带清晰可见，且大小也是对的。将回收的载体片段与目的基因用连接酶连接（用过宝生物的T4连接酶，现改为NEB的），转化、涂板，来来回回做了不知道多少遍了，现在是在是不知道该怎么办了，哪位做过、遇到过这些问题的大侠帮帮吧，谢谢啦！ |
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45楼2012-08-26 18:30:58