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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 在克隆的时候你遇见过这样的问题吗？
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刘仕博

金虫 (著名写手)

[求助] 在克隆的时候你遇见过这样的问题吗？

最近在做RACE的克隆，有两个基因的5‘断在PCR的时候只有400bp左右的长度，回收产物做克隆之后菌液的序列长度就变成了1000多，拿去测序的结果却什么都没有，上游引物和下游引物中间就只有个AC，连续做了两次结果都是一样的，请问这是什么原因造成的呢？
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生命在于折腾~
1楼 2012-02-02 12:41:12
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amilie030312

金虫 (正式写手)
载体多长，是不是没连上空载啊
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2楼2012-02-02 12:59:33
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流！ 2012-02-02 18:31:13
这个应该是没连上，也就是实验失败了。
这种情况我遇到过，酶切鉴定跟我的片段一样大小，可是拿去测序测出来什么都不是。
你的测序引物没什么问题的话就重新做吧。
重点检查一下你的感受态，以及你的纯化试剂盒。都没问题的话，直接拿你的PCR回收产物去测序吧，看一下是不是一个错配片段。
好运。
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3楼2012-02-02 13:32:23
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物扩过质粒吗？污染了吗？
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jiayoubashaonian
4楼2012-02-02 14:28:30
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hooter86

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议重新做一遍吧 ,很可能是你在扩增目的片段时出现问题了
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5楼2012-02-02 16:57:05
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snowdeshijie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没有连上载体吧，有没有提取质粒做验证？建议重新做！
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6楼2012-02-03 14:16:02
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刘仕博

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by amilie030312 at 2012-02-02 12:59:33:
载体多长，是不是没连上空载啊

载体有个1000多BP，第一次碰见这个事情，打算直接那回收产物去测个序~先谢谢啦~
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生命在于折腾~
7楼2012-02-05 17:28:20
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刘仕博

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yabxxh at 2012-02-02 13:32:23:
这个应该是没连上，也就是实验失败了。
这种情况我遇到过，酶切鉴定跟我的片段一样大小，可是拿去测序测出来什么都不是。
你的测序引物没什么问题的话就重新做吧。
重点检查一下你的感受态，以及你的纯化试剂盒 ...

嗯嗯，我也是这么打算的，十分感谢！
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生命在于折腾~
8楼2012-02-05 17:28:58
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刘仕博

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-02-02 14:28:30:
引物扩过质粒吗？污染了吗？

不打算做质粒了，有点麻烦，呵呵~
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生命在于折腾~
9楼2012-02-05 17:29:33
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刘仕博

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hooter86 at 2012-02-02 16:57:05:
建议重新做一遍吧 ,很可能是你在扩增目的片段时出现问题了

好的，谢谢！
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生命在于折腾~
10楼2012-02-05 17:29:57
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