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liangyou

铁杆木虫 (著名写手)

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[求助] 关于测定植物CAT的问题

本人用紫外分光光度法中的连续记录法测定过氧化氢酶的活力，但是每隔30秒测得的值如下：1.520，1.520，1.515，1.517，1.519，1.518。
测了近百组数据，都是这样的不稳定，而且变化值极小，POD和SOD数据测出来还都是正常的，可不可以求助一下大家，为什么会出现这个情况！

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1楼 2012-01-19 20:27:52

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starseacow

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
liangyou(金币+10): ★★★很有帮助我要去看看实验真正的结果，可不可以把你的实验方案发给我下啊，谢谢了！ 2012-01-27 00:43:21
amisking(APEPI+1): 鼓励积极应助！ 2012-01-27 17:38:07

你的CAT反应液组成是什么？加入粗酶液后有没充分混合？
你可以按照不安的-heart 的建议试试，但你同时在棉花与龙葵中遇到这样的问题，我怀疑还有别的某步操作有问题。

我过去做黄花蒿植株及发根的CAT检测，方法参考Zhou B et al. J Exp Bot, 2005, 56: 3223-3228
酶提取：取不同处理的新鲜黄花蒿发根0.500 g，在4 ml预冷的磷酸钾酶提取缓冲液中冰浴研磨，10000 r/min 4℃离心15 min，取上清液作为酶待测液。
检测：取0.1 ml待测酶液，加入0.05 mol/l pH 7.0磷酸钾缓冲液1.4 ml，40 mmol/l H2O2 1.5 ml，立即计时，测定波长240 nm处吸光度值，每隔30 s读数一次，共测定4 min。以不含酶待测液作为空白对照。CAT活力以ΔA240/Δt=0.001/min为一个酶活力单位（U），比活力为U/mg蛋白。
（磷酸钾酶提取缓冲液：0.05 mol/l pH 7.0磷酸钾缓冲液中，含1%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮，1 mmol/l苯甲磺酰氯，1 mmol/l EDTA，1mmol/l DTT与0.2% Triton X-100。）