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wangdunzju新虫 (小有名气)
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RACE克隆基因，棘手案例，请高手帮忙分析原因！已有4人参与
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各位大侠，大家好，鄙人最近在做race 克隆基因时遇到一个问题十分棘手，希望能都得到高人的指点。太郁闷了，近一个月的工作量都白费了。 具体情况是这样的： 我在不同物种中克隆同一个基因（可能是个小型的基因家族），用已知物种该基因的保守序列设计了一系列的引物。挑选其中好用的引物作为GSP引物做Race。具体步骤如下： 1、第一轮Race，用UPM和GSP-1引物做touch-down PCR，目的条带不明显。有弥散带存在。  2、产物稀释50倍后进行第二轮RACE，引物用剿式引物NUP和NGSP-2 扩增（Tm=68度），结果一部分样品都出现了条带，大小符合目的条带的预测范围（1Kb左右）。  3、将目的片段切胶回收，用的生工的胶回收试剂盒。胶回收后电泳检测：  4、用TAKARA或者英骏的TAclone试剂盒（两种都用过）做TA克隆，蓝白斑筛选（既有蓝斑又有白斑），挑白斑摇菌，进行菌液PCR检验，用的引物是NUP和NGSP-2（就是第二轮RACE时用的引物），结果检测阳性率几乎是100%。 5、然后每个样品送2-3个克隆测序（送的新鲜菌液），用M13引物测序。 结果悲剧发生了，测序结果都不是我要的基因，而且更奇特的是：有20多个样的测序结果序列都95%同源，说明插入片段是一样的，或者是同源的序列，他们并不是载体序列，也不是目的基因，BLAST也没比出是哪个基因，他们都含有诸如“GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA”和“CTCTCTCTCTCTCTCTCTCT”这样的序列。 另外，对测序结果分析发现，找不到GSP引物序列，但是能找到NUP引物序列，说明测序好像没问题，因为只测了单向，所以没看到GSP引物序列可能是因为没有测通。但是目的片段总共才1000BP左右，单向测序已经到900左右了，咋么也见到一段目的序列才对啊，可是比对结果一点都比不上我的目的基因（比对时用的Somewhat similar sequences (blastn)选项）。 而且还有一点，部分测序结果中还找到两个NUP引物序列，分别在插入片段的两侧！即使克隆片段在700左右的样品，测序结果也找不到GSP引物序列，都只能找到NUP引物。难道是NUP引物出现了非特异性结合？ NUP是是RACE试剂盒中的引物，应该不会出现这样的情况吧？ 不知道，郁闷死了，现在老师出现这样的问题，一直拿不到目的基因序列。 请各位高手指点迷津啊！ 补充说明： 1、GSP引物应该是可以用的，因为之前部分样品用这些引物做出来过几个物种的克隆，克隆懂到了目的基因，但原来是用的52度RACE-PCR，后来因为做不出来的样品才使用了巢氏PCR，结果就遇到现在的情况了。 2、抗生素用的AMP（100ng/ml）。 |
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wangdunzju
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【答案】应助回帖
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| 您好，之前我也做过一些基因的RACE实验，以我的经验来看，您也谈到了部分测序克隆有两个UPM序列，应该是接头引物单引物扩增的结果，也就相当于您的基因特异引物没有发挥作用，您可以做个这样的PCR验证，单引物对照，也就是正常上下游引物扩增一管，相同条件下分别扩增一管上游引物（不加下游引物）和下游引物（不加上游引物）的对照，您会发现UMP单引物对照管和您的正常扩增有相同的扩增条带，这就证明了您前面的结果，所以一般情况下，我们进行RACE实验的第二轮PCR都需要进行单引物验证，如果证明是单引物条带，就不会继续进行克隆了，当然如果这里证明不是单引物条带，后续菌液或者菌落PCR也会进行单引物验证，确保万无一失。这种情况下您需要重新设计引物或者换一下接头引物试试，祝你好运！ |
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