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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » RNA干扰后mRNA表达量会上升吗？
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koko1210

铜虫 (正式写手)

[交流] RNA干扰后mRNA表达量会上升吗？

我做的是水稻材料，构建的一个基因RNA干扰，用QRT-PCR鉴定了一下，基因mRNA的表达居然上升，干扰材料没有弄错，很奇怪，不知道是什么原因，哪位高手给解释一下？不知道RNA干扰后有没有mRNA表达上升的例子？

非常感谢！
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1楼2012-01-16 09:11:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
小丹木木(金币+2): 鼓励积极交流哦 2012-02-18 08:10:18
可能是PCR用的引物问题。 注意不要在RNAi 敲除的区段设计引物（否则，检测结果表现为表达量显著提高），其中3'端引物应该位于RNAi 敲除的区段之后。仅供参考。
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29楼2012-02-17 16:42:45
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
koko1210(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+2): 鼓励交流！有道理！ 2012-01-16 16:28:33
同学，阳性，阴性对照设了吗？没有对照，就不好分析原因
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7楼2012-01-16 12:15:16
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koko1210

铜虫 (正式写手)
★ ★
送鲜花一朵
wanhscn(金币+2): 只要实验各方面没有问题，说不定有新发现在里面啊！ 2012-01-16 16:29:48
引用回帖:
楼: Originally posted by jiaxinfish at 2012-01-16 13:16:31:
可能是干扰没成功，反而是一种overexpression的表现，表型如何？

田间表型也不对，反而成了过量表达的表型～～
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13楼2012-01-16 15:12:48
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by koko1210 at 2012-01-16 16:12:48:
田间表型也不对，反而成了过量表达的表型～～

不好意思，才看到....
这个干扰序列是你设计的还是文献上已有的？要是是自己的设计的，出现上升也是有可能的，我找公司设计，一般都是设计2到3个，有些用了，我的目的基因要么没什么变化，要么还升了，那说明设计得不好。要是是文献报道的，别人做出来时下调的，那你就要看看是你哪的实验出问题了。
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27楼2012-02-17 09:30:03
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jacky1985310

新虫 (小有名气)
★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
楼主，不知道你的问题解决了没有。
你说之前用过这对引物测过野生型和突变体都没问题。请问你的引物设计位点在哪里？如果上下游引物都落在ORF里的话就会出现一个问题。你用于RNAi 的过表达序列也会被一同计算成目的基因的表达量。我是刚开始做RNAi，有个老师给我说普通的RT-PCR引物不适合于RNAi 表达量的检测。要重新设计引物，而且引物要设计在ATG的上游或者终止密码子的下游，这样就可以避免35S表达的用于RNAi 的序列也被算作植物本身的表达量。
不知道我的理解是否正确，希望能够相互讨论。
祝好！
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39楼2014-01-09 18:33:54
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)
★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
你设计的引物估计是在RNAi探针上了，我也做过RNAi的定量，才开始定量引物用的文献上的发现RNAi后表达量非常高，后来发现引物错了，又在RNAi探针以外基因序列上设计引物结果就理想了。探针序列在转基因植株中转录量很大，一旦定量引物设计在探针区域上，表达量肯定会变大。希望能帮到你。
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40楼2014-01-09 21:27:53
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
小丹木木(金币+2): 鼓励交流 2012-02-17 13:45:19
RNAi之后正常情况是要mRNA表达量下降的，但是如果你这个小RNA设计的不好，那有可能下降的水平有限，再通过定量PCR检测时候几个循环的误差就可以弥补回来下降那些的量了，所以尽量不要用太多的循环跑定量。
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28楼2012-02-17 12:49:55
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wuchuman

铜虫 (小有名气)
★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
送红花一朵
请问楼主这个问题解决了吗，我也是遇到这个做基因的RNA干扰后，基因mRNA表达量居然都上升，5个靶位点全部结果都上升
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50楼2015-12-26 12:43:55
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普通回帖

adole

至尊木虫 (知名作家)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
祝福 楼主 加油 ~~~
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2楼2012-01-16 09:37:47
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tangbohejin

木虫之王 (文学泰斗)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
真心祝福---------------
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3楼2012-01-16 09:50:36
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wangcheng2650

木虫 (正式写手)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
RNAi的原理是直接降解mRNA的，你升高了肯定有问题，难道是刺激了什么东东？
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4楼2012-01-16 11:07:07
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分子菜鸟

木虫 (小有名气)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
可能定量引物没设计好，造成了定量PCR的误差
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5楼2012-01-16 11:31:45
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xujiemeng09

金虫 (正式写手)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
重复试一下
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8楼2012-01-16 12:15:36
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水水洋子

新虫 (小有名气)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
++++
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9楼2012-01-16 12:52:55
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jiaxinfish

金虫 (正式写手)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
可能是干扰没成功，反而是一种overexpression的表现，表型如何？
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koko1210
10楼2012-01-16 13:16:31
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lawk00

铜虫 (小有名气)
★ ★
koko1210(金币+1):谢谢参与
小丹木木(金币+1): 鼓励交流 2012-01-16 16:41:17
有可能是你设计的干扰引物 没有效果啊！
重新设计引物，设计好对照，重新开始！
祝好运！
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11楼2012-01-16 13:26:06
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koko1210

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by nuoyaeva at 2012-01-16 12:15:16:
同学，阳性，阴性对照设了吗？没有对照，就不好分析原因

阴阳对照都是正确的，引物也没有问题，我之前用过这对引物做过野生型和突变体中的基因表达，没有问题
难道构建有问题，还是真的刺激其他基因，促使这个基因表达量提高？
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12楼2012-01-16 15:11:39
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userhung

禁虫 (文学泰斗)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
应该下降，祝福好运哦~~~~~~~~~~~~~~~`
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14楼2012-01-16 15:33:28
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adole

至尊木虫 (知名作家)
祝福 楼主 加油~~~~
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15楼2012-01-16 15:41:37
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Hugbum-Xia

金虫 (著名写手)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
祝福
顺利
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16楼2012-01-16 15:51:53
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wxf-er

银虫 (正式写手)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
查查文献吧，我记得有RNAi 提高表达水平的
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17楼2012-01-16 17:04:12
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beautybanana

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
koko1210(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+3, 专家考核): Good！ 2012-01-17 09:18:05
你是按照mRNA直接设计的干扰片段，那么就是特意性的，那为什么mRNA的表达量反而提高了呢，你说的提高了，提高了多少呢，有没有把误差的范围考虑在内呢，与内参相比，你看看对照组与实验组的差异到底是多少，绝对定量RT-PCR要求很严格的，很小的误差经过几十次循环PCR后，对结果造成的误差是累积的，这些是要分析的~
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19楼2012-01-16 17:49:37
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
koko1210(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+1, 专家考核): 鼓励应助！ 2012-01-17 09:17:15
如果楼主确定技术上不存在问题的话，能否看一下同源基因突变体的表型？
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22楼2012-01-16 21:36:39
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xiaohaiyu

金虫 (正式写手)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
这个问题，你可以认为是你做错了，浪费了时间和精力，但是仔细想想，会有心的什么东西发现呢？加油！
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23楼2012-01-17 10:14:15
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webmasterone752

金虫 (正式写手)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
有阳性对照吗？？？引物设计的质量如何？？
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24楼2012-01-18 07:50:01
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smurfen

至尊木虫 (著名写手)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
不懂哦，绑定了
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25楼2012-01-18 09:15:33
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haizhefang

金虫 (小有名气)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
不是反了吗？
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26楼2012-01-20 15:25:26
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xiaoee2728

金虫 (小有名气)
★
koko1210(金币+1):谢谢参与
RNA干扰成功后mRNA的水平是应该下降的，当然这要在合适的时间点测定才能得到预期的结果，Q-PCR的结果本身就很不稳定，不排除是这个实验本身的问题。希望能帮到你
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31楼2012-03-08 14:52:43
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koko1210

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by lixg at 2012-02-17 16:42:45:
可能是PCR用的引物问题。 注意不要在RNAi 敲除的区段设计引物（否则，检测结果表现为表达量显著提高），其中3'端引物应该位于RNAi 敲除的区段之后。仅供参考。

谢谢！
这是什么原理呢？为什么在RNAi的两端设计引物会使其表达量提高呢？
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32楼2012-03-11 00:27:54
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koko1210

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by amilie030312 at 2012-02-17 12:49:55:
RNAi之后正常情况是要mRNA表达量下降的，但是如果你这个小RNA设计的不好，那有可能下降的水平有限，再通过定量PCR检测时候几个循环的误差就可以弥补回来下降那些的量了，所以尽量不要用太多的循环跑定量。

好的，谢谢！
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33楼2012-03-11 00:28:34
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koko1210

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by nuoyaeva at 2012-02-17 09:30:03:
不好意思，才看到....
这个干扰序列是你设计的还是文献上已有的？要是是自己的设计的，出现上升也是有可能的，我找公司设计，一般都是设计2到3个，有些用了，我的目的基因要么没什么变化，要么还升了，那说明设 ...

是自己设计的引物，文献没有报道它的定量结果，所以也就没有QRT引物。
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34楼2012-03-11 00:29:53
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koko1210

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by wxf-er at 2012-01-16 17:04:12:
查查文献吧，我记得有RNAi 提高表达水平的

是吗，如果有时间的话，能否给一下文献，谢谢啊！
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35楼2012-03-11 00:31:46
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koko1210

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by beautybanana at 2012-01-16 17:49:37:
你是按照mRNA直接设计的干扰片段，那么就是特意性的，那为什么mRNA的表达量反而提高了呢，你说的提高了，提高了多少呢，有没有把误差的范围考虑在内呢，与内参相比，你看看对照组与实验组的差异到底是多少，绝对定 ...

提高了1倍多，误差还没有算，您说的是技术误差还是生物学误差？
赞一下 回复此楼
36楼2012-03-11 00:36:10
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beautybanana

木虫 (著名写手)
引用回帖:
36楼: Originally posted by koko1210 at 2012-03-11 00:36:10:
提高了1倍多，误差还没有算，您说的是技术误差还是生物学误差？

首先要把技术误差分析一下，1倍也就是0点几个CT，所以应该要分析分析的
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37楼2012-03-11 17:33:53
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
怎么得出来的结论？内参基因的mRNA下降倒是可能。
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41楼2014-01-14 12:57:37
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
13楼: Originally posted by koko1210 at 2012-01-16 15:12:48
田间表型也不对，反而成了过量表达的表型～～...

这说明了你的qRT-PCR结果是可靠的。
问题出在siRNA的设计上吧
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42楼2014-01-14 16:02:32
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yeschuang

新虫 (初入文坛)
★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
做个northern blot试一试。
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43楼2014-09-25 12:24:11
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雁阵惊寒

新虫 (初入文坛)
★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
您好，现在这个问题解决了吗？我也遇到这个问题了
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44楼2015-04-02 21:39:17
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清水如画

铜虫 (初入文坛)
★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
40楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-09 21:27:53
你设计的引物估计是在RNAi探针上了，我也做过RNAi的定量，才开始定量引物用的文献上的发现RNAi后表达量非常高，后来发现引物错了，又在RNAi探针以外基因序列上设计引物结果就理想了。探针序列在转基因植株中转录量很 ...

如果说有的上升了，有的下降了呢，这个怎么解释？
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45楼2015-04-03 14:42:14
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雁阵惊寒

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by wxf-er at 2012-01-16 17:04:12
查查文献吧，我记得有RNAi 提高表达水平的

您好，请问您知道这是哪一篇文献吗？非常感谢，我的结果也是这样
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46楼2015-04-09 16:34:18
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雁阵惊寒

新虫 (初入文坛)
楼主，您的问题解决了吗、？我的结果也是表达升高了
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47楼2015-04-09 16:37:28
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美美特别强大

新虫 (初入文坛)
★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
47楼: Originally posted by 雁阵惊寒 at 2015-04-09 16:37:28
楼主，您的问题解决了吗、？我的结果也是表达升高了

我的也出现了这样的问题，表达量高出了3倍多，你是怎么解决的呢？谢谢~
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48楼2015-07-09 21:33:41
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粪坑里的石头

新虫 (小有名气)
★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
真的好神奇？居然是表达变高了，导入的基因RNA干扰是调控你要检测表达的那个基因 ？
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49楼2015-07-10 09:28:53
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简单回复
?@?笑笑6楼
2012-01-16 11:43   回复  
koko1210(金币+1):谢谢参与
wangxin10118楼
2012-01-16 17:36   回复  
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jinyuye20楼
2012-01-16 18:07   回复  
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taoxie197721楼
2012-01-16 18:08   回复  
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mine800830楼
2012-03-05 15:28   回复  
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jiangronglu38楼
2013-04-15 19:18   回复  
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