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shenxing325

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助,Western-Blot转膜不成功

各位虫友,做了两次Western-Blot转膜都不成功,想各位帮我指点一下可能的原因,这些是我做实验的时候的条件细节:
        目的蛋白大小100kD左右,用的是湿转法,电转缓冲液(5×)的配方是:
        Glycine   15.1g
        Tris         72g
        SDS        5g
        定容至一升,使用前取200mL,再加700mL水和100mL甲醇,4度备用
        滤纸(3mm滤纸用两边各用两层)比膜和胶大比较多,之前看过一些人说滤纸要比膜小,但是好像大多数人都说对于湿转来说没有关系。
        膜用的是0.45um的PVDF膜,这个有人说要用0.22um的,是这样吗?
        电转于4度冰柜中进行,80V电压,时间2h,用立春红染色,但是什么都没有,我没有用预染Marker。
       看大多数人都说湿转是非常容易成功的,我的实验操作哪里有问题吗?请指教,谢谢!
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shenxing325

铜虫 (小有名气)

对于上面的问题:
1.正负极是确认过的,膜也在使用前用甲醇活化了
2.不用预染Marker是因为一开始打算用可逆的铜染法进行染色的,所以没有买预染的Marker,但是后来没有染色成功。这也是我想请教的事情,关于铜染法,为什么我染色出来什么都没有啊

继续等待大家回答
6楼2012-01-13 12:39:35
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

也有可能是转过头……
2楼2012-01-12 21:14:25
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山东老杜

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
电压低点

怎么不加个预染marker
3楼2012-01-12 22:34:14
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我用的是NC膜,一般喜欢用300mA横流转1个小时或者90分钟(大分子),从来没有出过问题。
没用过PVDF膜,所以不知道你的电压条件什么的是不是合适,不过PVDF膜需要先用甲醇活化正电基团,不知道你活化了没有。
4楼2012-01-13 07:25:42
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