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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » TD-PCR 退火温度及程序的设计
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苏南81

木虫 (初入文坛)

[求助] TD-PCR 退火温度及程序的设计

求助： 我在做TD-PCR 所用引物的Tm值分别为52.18和63.95。
我的退火温度和程序应该怎么设计？
之前做过一部分预实验（退火58-53），只是出现隐约的目的条带，且非特异和弥散很严重，原因是什么？
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守候幸福
1楼2012-01-02 11:28:55
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857(金币+1): 我最近也需要做pcr，设置梯度是个好办法啊 2012-01-03 13:21:21
试试50-65，设置15个循环，每个循环1℃的梯度，再50摄氏度15-20个循环。
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Thank-you，so-blue.
2楼2012-01-02 12:47:36
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苏南81

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by susizheng at 2012-01-02 12:47:36:
试试50-65，设置15个循环，每个循环1℃的梯度，再50摄氏度15-20个循环。

谢谢！试过了，结果不好。
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守候幸福
3楼2012-01-02 19:15:25
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
把你目标片段大小 还有 退火时间跟延伸时间发上来看看
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4楼2012-01-04 10:10:24
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苏南81

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 老夏853 at 2012-01-04 10:10:24:
把你目标片段大小 还有 退火时间跟延伸时间发上来看看

片段大小：900bp，退火45s，延伸90s
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守候幸福
5楼2012-01-04 11:54:51
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857(金币+1): 鼓励交流 2012-01-04 16:59:15
同意二楼的说法  65- 50  
不过建议 最后的20个循环退火温度稍微高一点，一般是 普通pcr 的退火温度，
另外 弥散可能是模板降解或者模板浓度过大引起的   
检测模板质量 并且稀释模板  做梯度试验。
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6楼2012-01-04 13:32:02
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