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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 从DNA提取到实时荧光定量PCR，求交流~~
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)

[交流] 从DNA提取到实时荧光定量PCR，求交流~~已有17人参与

做荧光定量PCR之前，我把模板电泳检验了一遍（之前不是我提的），发现有的模板根本没有条带出现，有的呈现讲解现象，测得的OD值也很低，但是PCR时却有溶解曲线，这是神马情况？
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安仔

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做自己喜欢的事情，心态决定一切~
1楼2011-12-28 11:04:37
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3): 鼓励发帖交流。 2011-12-28 18:46:52
荧光定量PCR的模板一般是cDNA吧？一般是提的总RNA，再反转录成总的cDNA，这样子的cDNA模板各种大小的cDNA都有，所以泳道是弥散状的（你说的“降解”）。cDNA不要拿来跑电泳，首先是看不到什么信息，其次是浪费（反转录酶非常贵）。
当然也有拿基因组DNA或其他的来做荧光定量PCR。PCR是一个很灵敏的过程，微量的模板就可以做了，模板跑电泳看不到东西不代表做不出PCR的哦，
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5楼2011-12-28 13:09:44
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普通回帖

love_st

金虫 (著名写手)
★
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这说明荧光PCR比常规PCR灵敏度要高
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2楼2011-12-28 11:11:04
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by love_st at 2011-12-28 11:11:04:
这说明荧光PCR比常规PCR灵敏度要高

那用这样的模板做定量准确吗？还有就是，DNA中有RNA没除去，对结果有影响吗？
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做自己喜欢的事情，心态决定一切~
3楼2011-12-28 12:02:19
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love_st

金虫 (著名写手)
★
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模板浓度太低重复性肯定不好了啊
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4楼2011-12-28 12:06:25
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-12-28 13:09:44:
荧光定量PCR的模板一般是cDNA吧？一般是提的总RNA，再反转录成总的cDNA，这样子的cDNA模板各种大小的cDNA都有，所以泳道是弥散状的（你说的“降解”）。cDNA不要拿来跑电泳，首先是看不到什么信息，其次是浪费（反 ...

谢谢你的解答~
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6楼2011-12-28 13:54:38
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by love_st at 2011-12-28 12:06:25:
模板浓度太低重复性肯定不好了啊

非常感谢~
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7楼2011-12-28 13:54:51
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
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引用回帖:
6楼: Originally posted by 欧朵拉 at 2011-12-28 13:54:38:
谢谢你的解答~

看来是cDNA了？那测OD也没必要的，量本来就很少，得不到什么信息的。如果要检验cDNA的质量，可以用内参基因来做PCR，能跑出来的话就没问题。
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8楼2011-12-28 14:56:42
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xiaomage9527

金虫 (正式写手)
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西瓜(金币+2): 鼓励交流！ 2011-12-29 17:35:32
有溶解曲线跟你的模板有关系吗？    溶解曲线只反映你的引物情况而已。  此外，电泳的水平怎么能和荧光PCR相比较，差多个数量级呢
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9楼2011-12-29 17:05:23
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kidluag

金虫 (正式写手)

不自信的师生
★
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正常情况，荧光检测灵敏度低而且有的时候亮度过于小肉眼看不到，PCR不正好是对DNA的扩增么，扩增之后DNA的含量大大提升了才继续进行后面的操作，PCR-DAGE当然有溶解曲线了
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被迫的无知小小博
10楼2012-02-22 04:22:14
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