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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNA提取的问题么
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mxlo.o

金虫 (正式写手)

[求助] RNA提取的问题么

从真菌中扩增一个基因，全长3kb左右，mRNA长度2kb左右；自己设计的引物以DNA为模板能够扩增出来，但是以cDNA为模板不能够能够扩增出来。提取的RNA扩另一个基因（819bp）能够扩增出来，请问各位高手，原因出在哪呢？
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1楼 2011-12-19 20:59:59
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 有道理！ 2011-12-19 22:27:43
mxlo.o(金币+2): ★★★很有帮助 2011-12-23 16:21:30
反转超过2K效率下降哇，模板太少，建议楼主做二次PCR
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2楼2011-12-19 22:17:13
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mxlo.o

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-19 22:17:13:
反转超过2K效率下降哇，模板太少，建议楼主做二次PCR

扩增不出来，怎么做二次PCR？
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3楼2011-12-21 08:58:14
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pmay

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+1): 我相信楼主应该不会犯这种错误! 2011-12-21 10:23:45
mxlo.o(金币+2): ★有帮助 2011-12-23 16:21:43
引物设计的有问题吗？是不是跨内含子的？
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-12-21 09:45:45
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励热心应助！ 2011-12-21 18:35:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by mxlo.o at 2011-12-21 08:58:14:
扩增不出来，怎么做二次PCR？

看不见未必扩增不出来，根据自己经验，如果体系没有问题，三十五个循环能把低于10ag的纯模板成功扩增，而以10ng 反转产物为模板，即使模板不足总量的亿份之一，也有可能通过二次PCR做出来。除第一次非扩增体系非常不合适，不然二次还是很有可能出来
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2011-12-21 11:33:34
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