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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DNA 条带 和 OD值
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5xiaosh

银虫 (小有名气)

[求助] DNA 条带 和 OD值

继前面RNA条带和OD值哪个更重要的帖子，我也提一下自己最近实验遇到的问题，请大侠们看看。我是第一次做，遇到这样的问题，不知该怎么解释？

最近从新生裸鼠组织里提 rna（用的试剂盒）  测浓度60ng/ul 测OD值A260/A280=2.0  我没有跑胶看 分装后冻到-80的冰箱里去了   过了不到1周  我今天取了一管 测浓度50ng/ul
  A260/A280=2.15   然后 我用试剂盒（takara）做逆转录 扩cdna   反应后测浓度869ng/ul，OD值A260/A280=2.06， 然后用该cdna模板做pcr（10ul反应体系，cDNA稀释了10倍，加了2ul），设计了4对引物，做了4管， 同样反应结束后测DNA浓度 500ng/ul OD值A60/A280=1.8多  可是跑胶 （我加了7ul 扩增样品，2.5ulbuffer） 却什么都没跑出来 很干净  。为什么测浓度，测OD值都有，却没有条带呢 ？
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1楼 2011-12-17 17:59:44
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bready

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
5xiaosh(金币+1): 嗯，谢谢。 2011-12-20 14:30:29
很有可能是你的总RNA已经降解了！提取完还是要跑胶检测的！
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加油
2楼2011-12-18 00:28:15
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5xiaosh

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by bready at 2011-12-18 00:28:15:
很有可能是你的总RNA已经降解了！提取完还是要跑胶检测的！

谢谢您 RNA电泳  跟DNA 电泳一样吗 ？  有什么特别注意的吗 ？
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3楼2011-12-18 12:19:41
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bready

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

浓度不一样，其他的没有区别，还有你提取的总RNA如果要经常用，要分装！不要经常冻溶！
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加油
4楼2011-12-18 13:40:39
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5xiaosh

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by bready at 2011-12-18 13:40:39:
浓度不一样，其他的没有区别，还有你提取的总RNA如果要经常用，要分装！不要经常冻溶！

有protocol吗  我们实验室还没做过rna电泳  对这方面很无知（^_ -）
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5楼2011-12-18 13:53:44
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zh712ang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
5xiaosh(金币+2): 谢谢，很详细。 2011-12-20 14:32:00
引用回帖:
3楼: Originally posted by 5xiaosh at 2011-12-18 12:19:41:
谢谢您 RNA电泳  跟DNA 电泳一样吗 ？  有什么特别注意的吗 ？

RNA电泳注意的事情比较多：电泳槽要除RNase0.5MNaCl浸泡20min，用DEPC水配置缓冲液，高电压短时间跑电泳 总的来说就是减少和RNase接触的时间
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6楼2011-12-18 14:20:20
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5xiaosh

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by zh712ang at 2011-12-18 14:20:20:
RNA电泳注意的事情比较多：电泳槽要除RNase0.5MNaCl浸泡20min，用DEPC水配置缓冲液，高电压短时间跑电泳 总的来说就是减少和RNase接触的时间

0.5MNaCl浸泡电泳槽后的废液  倒哪里呢  因为那槽子可能被EB污染过了  装个瓶子里吗？？  我提RNA 测OD 测浓度 都没问题  就是做不出后面的克隆  我都怀疑我的RNA 是不是提出来时就讲解差不多了   才想做这RNA 电泳
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7楼2011-12-18 14:51:44
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们实验室没有那么严格，直接倒下水道了。不过我们是后染色，所以电泳槽里EB污染不多。
据说放在大阳底下晒晒也可以降解EB，楼主可以放在太阳下暴晒几天再倒。
其实最好就是用个电泳槽独立出来专门跑RNA用。
配胶及电泳液都用新配的电泳液。loading最好也用一管新的。
一般配1-1.5%的胶，7-9V/cm电泳15-20min（溴芬兰出孔约2cm），多跑几次总结总结经验就可以了。可以点个DL2000的DNA Marker。
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伟大航线....
8楼2011-12-19 10:22:38
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

5xiaosh: 回帖置顶 2011-12-20 14:32:56
5xiaosh(金币+2): 我在逆转录反应前测了一下ep管里的反应液OD，500多ng/ul。现在发现是cDNA没有扩出来，因为我没加Rnasin。O(∩_∩)~ 2011-12-20 14:35:59
你扩完的cDNA怎么能测浓度呢？如果你是直接测浓度里面一大堆乱七八糟的东西，测出来的浓度完全没有可信度。
你做PCR的时候加一个阳性对照（actin什么的），你只用你自己设计的四个引物做很难说明问题，可能本来PCR体系或引物就有问题。
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伟大航线....
9楼2011-12-19 10:26:40
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5xiaosh

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by longrna at 2011-12-19 10:22:38:
我们实验室没有那么严格，直接倒下水道了。不过我们是后染色，所以电泳槽里EB污染不多。
据说放在大阳底下晒晒也可以降解EB，楼主可以放在太阳下暴晒几天再倒。
其实最好就是用个电泳槽独立出来专门跑RNA用。
...

电泳后在染色，具体怎么操作？我们这没大太阳，只能放桶里，让实验废品处理的来收拾。DNA Marker我们用的是天根的。（^_ -）
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10楼2011-12-19 11:37:38
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