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做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why???
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我的目的基因大小是600多bp,两端加的是SmaI,SacI。首先是连在easy-T载体上，酶切鉴定可以切出目的条带。 用XmaI,SacI分别切T载体和我的表达载体，切T可以切出目的片段，表达载体本来两个酶切位点中间有1000多的片段，用上述两个酶切也可以切出，将我的目的片段和表达载体回收，连接，转化，连续做了5，6次，有几次是不长菌，有三次都只长一个菌，但是提质粒，质粒大小明显变小，我的表达载体是10K多，只跑出一条3K的带，酶切鉴定的结果是切出两条带，一条3K多，一条5K以上的带，没有目的条带。。。。 首先涂板的抗性问题可以排除，是正确的。。。 连接转化也换过别人做，也是同样的结果。。 且有3次都是同样的长一个菌。。。提质粒酶切结果也是一样。。。 每次连接的载体和目的基因都是重新切的。。。 补充：提质粒，胶回收均使用的试剂盒。。。且回收后跑胶，可以清晰看到自己目的片段和载体。。。 这是载体的大小还是5K以上。。。但是一连接转化就不对 了。。。。已经做了一个多月了。。。请大家帮分析一下吧。。万分感谢！！！！！ |
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guoqin_shiyin
银虫 (正式写手)
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21楼2015-06-08 19:20:17