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real339金虫 (正式写手)
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[求助]
原位杂交技术求助
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各位战友： 本人想做植物材料的原位杂交，但没有经验，想求一份详细的试验步骤，越详细越好，包括试剂的纯度要求，配制方法和保存方式，保存期限等。是在不知道怎么下手，先谢过了。如若需要本人愿意分享自己的一些经验，包括原核表达，农杆菌介导的转基因，以及基因克隆，载体构建，gene-walking，等方面。 |
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chenguestc
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 辛苦~ 2011-12-07 18:50:05
real339(金币+6): 谢谢啦。 2011-12-08 11:13:19
西瓜(金币+4): 辛苦~ 2011-12-07 18:50:05
real339(金币+6): 谢谢啦。 2011-12-08 11:13:19
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原位杂交操作流程 1. 压片，速冷揭去盖片，室温干燥1天然后-20℃保存备用。 2. 制片处理：滴加50-100µL 70%的甲酰胺（用2×SSC配置），盖上盖片。 80℃处理2min, 拿出后迅速甩掉盖片。迅速依次放到-20℃预冷的梯度酒精中（70%，95%，100%酒精各5min或以上）。 3. 处理完自然干燥。 4. 配置杂交体系： 去离子甲酰胺 7.5µL 20×SSC 1.5µL ssDNA（鲑鱼精DNA） 1.5µL B-DNA（封阻） 1µL 50%DS(葡聚糖) 3µL Probe 1µL 上述体系配置完成后，瞬时离心（闭光），然后80℃变性10min。变性完后，迅速放到冰上处理5min以上。 5. 把上述体系滴加到玻片上，盖片，然后周围涂上无色指甲油保温密封。放入 37℃饭盒里反应8h以上或过夜。 6. 用镊子将指甲油剥掉，将标本片浸入2×SSC的染色缸中，轻轻摇动使盖片脱落。 7. 再按照下列步骤清洗： 2×SSC 室温 5min 2×SSC 42℃ 10min 2×SSC 室温 5min 1×PBS 室温 5min 离心管中加入0.5-1%抗小牛血清（用1×PBS配置）100µL，再加入1µL Fab,斡旋混匀，滴加到盖片上（滴加时标本不要太干燥），盖上盖片，37℃条件下，45min或以上。 8. 按照步骤7清洗 9. 自然闭光干燥后滴加PI，盖上盖片镜检。 70％甲酰胺/2×SSC： 35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水 2×SSC： NaCl 17.53g 柠檬酸三钠（带结晶水） 8.82g 定容至1000ml 10×PBS: NaCl 75.972g Na2HPO4.12H2O 25.0698g NaH2PO4.2H2O 4.6803g 定容至1000ml 以上是基因组原位杂交程序，如果你是利用分离的重复序列或者BAC作为探针的话那要根据需要确定是否加封阻DNA，探针标记可以购买，个人觉得罗氏的不错。 |
2楼2011-12-07 08:29:49
chenguestc
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