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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RED基因敲除
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thestormcong

银虫 (小有名气)

[求助] RED基因敲除

各位师兄师姐好，小弟最近想做red重组系统的基因敲除，现在在设计引物，查看了一些文献，都说鉴定引物需要设计在同源臂两侧，那为什么鉴定引物就不能设在同源臂上呢，我想设在同源臂上看看，这样行吗？还有各位师兄师姐都提供以下相关的经验技术，因为以前也从来没做过这个，没啥经验呢。还有我要敲除的菌株没有能够查到其基因组序列，ncbi上没有提交，而相近的一些菌株则有这个基因，这些基因比对了之后80-90%都是同源的，我能否直接根据相近的这些基因来设计引物呢，请求指教，非常感谢！
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1楼 2011-11-25 22:01:16
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凡子1985

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
1949stone(金币+1): 同意 2011-11-25 23:14:25
可以 设计在两侧 只是为了证明重组的locus是正确的  依照你的情况 没有确切的序列 而且如果设计在两侧 同源性可能连80-90%都没有了 没法设计引物
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thestormcong
2楼2011-11-25 22:33:54
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): Good！热心！专业！ 2011-11-26 20:36:08
thestormcong(金币+5): 希望能够得到指点。小弟还没有相关经验，谢谢。 2011-11-27 12:09:14
wanhscn(MolEPI+1): 根据楼主反映，理应授予专家指数！补上！ 2011-11-27 16:09:01
1）设计验证引物可以在两侧同源臂上，验证时突变株和野生型PCR条带会有区别很容易看出来的！
2）如果你要敲除的目的片段很长大于5kb，那么验证时PCR不是很方面，当然也可以设在你要敲出的目的片段上，如果是正确的突变株理论上是P不出来的，而野生型的能P出来！
3）显然不能依据其他基因的同源序列来设计验证引物的，你可以根据这些同源序列设计一个兼并引物，筛选你的目的基因后再在你的目的基因的基础上walking几个反应不就拿到你要的序列了吗？
祝实验顺利！
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3楼2011-11-26 15:15:45
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凡子1985 at 2011-11-25 22:33:54:
可以 设计在两侧 只是为了证明重组的locus是正确的  依照你的情况 没有确切的序列 而且如果设计在两侧 同源性可能连80-90%都没有了 没法设计引物

恩，懂了，谢谢你的回答。以后多多交流！
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4楼2011-11-27 11:55:24
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by srlee at 2011-11-26 15:15:45:
1）设计验证引物可以在两侧同源臂上，验证时突变株和野生型PCR条带会有区别很容易看出来的！
2）如果你要敲除的目的片段很长大于5kb，那么验证时PCR不是很方面，当然也可以设在你要敲出的目的片段上，如果是正确 ...

小弟知识有限，还是没能完全理解第三句话的意思。你说我如何才能得到我的目的基因序列？现在还有一个问题，就是我想根据相关同源序列来设计同源臂，同源臂大概也有个50bp，我觉得我这样设计出来的同源臂应该也能起到置换的作用吧，虽然不一定每个碱基都与目的基因相同，但绝大部分是相同的，这样可以吗？
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5楼2011-11-27 12:07:07
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thestormcong

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凡子1985 at 2011-11-25 22:33:54:
可以 设计在两侧 只是为了证明重组的locus是正确的  依照你的情况 没有确切的序列 而且如果设计在两侧 同源性可能连80-90%都没有了 没法设计引物

还能问一个问题吗？就是我要验证我的pkd46质粒是否有效果，转进我的宿主菌之后，能否验证它的三种蛋白的表达呢？
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6楼2011-11-27 12:11:20
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