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xiangquanju金虫 (小有名气)
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[求助]
做过用同源重组进行基因敲出的朋友请进，PCR做不出来！！
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利用同源重组的原理，打算敲掉大肠杆菌的一个基因，以pKD4为模板，打算扩增一段带有卡那霉素抗性基因的片段，作为重组筛选的标记。 上下游引物均有70bp，其中20bp是和质粒模板互补的，其余50bp是和基因组上欲敲除的基因互补的。与质粒互补的20bp，Tm值分别为47和60，PCR一直都只有引物带，退火温度从30--50度都试过了，也尝试了pfu和KOD聚合酶，都没什么改进 所以恳请做过类似实验的虫友指点指点 |
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