应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于Q-PCR的一些疑问
52/1返回列表
查看: 2875  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 2 个 BioEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

tco_001

新虫 (小有名气)

[求助] 关于Q-PCR的一些疑问

最近在做Q-pcr，要扩增一个表达量很底的mRNA
设计了引物上机去做，溶解曲线不单一有两个峰，一个大一点一个小一点，大一点的应该是产物，但两峰高度差距不算太大，距离倒是蛮远的
扩增曲线测定的Ct值在32左右，由于样品的原因，提取的RNA可能不是很纯，RNA浓度也不好提高了
改变过退火温度，变化不大
换过很多引物，由于这个mRNA丰度太低，很多的引物都扩不出来
仪器自动分析的CT值在复孔之间差距0.5以内
想问一下，我这个数据可以用么，如果不行要怎样提高扩增的特异性或者怎样改变一下？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2011-11-14 21:25:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tco_001

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by terry130 at 2011-11-16 21:34:04:
不是让你用两台机器啊，是用同一台机器做。只要是同一台机器，条件就是通用的

懂了，再次感谢
回复此楼
11楼2011-11-16 22:17:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-15 17:53:01
tco_001(金币+10): 2011-11-16 16:38:38
应该是有第二扩增造成的溶解曲线分离。这样的数据不能用的。你必须得换引物，知道找到合适的位置。。你做的基因组有没有全序列信息？如果有的话应该不难找到一对专一的引物。
赞一下(1人) 回复此楼
摒气动方息，宁神心自明。
2楼2011-11-15 08:08:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tco_001

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by terry130 at 2011-11-15 08:08:30:
应该是有第二扩增造成的溶解曲线分离。这样的数据不能用的。你必须得换引物，知道找到合适的位置。。你做的基因组有没有全序列信息？如果有的话应该不难找到一对专一的引物。

那是不是只要我的溶解曲线的峰时单一的就可以认为我的数据是可用的呢？
不知道在哪里看到说ct值超过30得出的结果就不是很可行了，毕竟qpcr的影响因素太多了
赞一下 回复此楼
3楼2011-11-15 16:35:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by tco_001 at 2011-11-15 16:35:41:
那是不是只要我的溶解曲线的峰时单一的就可以认为我的数据是可用的呢？
不知道在哪里看到说ct值超过30得出的结果就不是很可行了，毕竟qpcr的影响因素太多了

你要理解溶解曲线的含义啊。 他是cycle-signal曲线的导数曲线。一个标准的cycle-signal所对应的溶解曲线就应该是单峰的。这个只是数据可用的必要条件。并不是充分条件。如果你的非特异扩增曲线跟你的特异扩增曲线很相近的话，那么他们的溶解曲线仍然是单峰，但这种情况下的数据也是不可用的。这也是taqman探针法的优势所在了。~
赞一下 回复此楼
摒气动方息，宁神心自明。
4楼2011-11-15 18:47:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭