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【答案】应助回帖
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木虫/panda(金币+10, 农林EPI+1): 感谢您的积极应助，欢迎常来农林版~ 2011-11-16 22:24:50
jiyanhai1988(金币+2): 谢谢 2011-11-19 18:50:56
GOT和GPT我以前测过，GPT方法也有，见下面。如果实验经费不紧张的话，建议用试剂盒测，测起来比较方便。且GOT和GPT的试剂盒价格不贵的，一般用的是南京建成的。
谷氨酸丙酮酸转氨酶（SGPT）测定（King氏法）
原 理
生物体内转氨基作用是α-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到α-酮酸的酮基位置上，生成相应的酮酸与氨基酸的化学反应。催化这反应的酶称尾转氨酶，其辅酶为磷酸吡哆醛。转氨酶广泛存在于存在机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase,GPT）,谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase,GOT）活性较高。在正常新陈代谢过程中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释放至血流中，从而引起血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性显著升高。因此测定这些酶的活性对某些疾病的临床诊断具有重要的参考价值。
本实验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物（基质液成分）经谷丙转氨酶作用生成谷氨酸及丙氨酸。丙氨酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物在碱性条件下呈棕红色。根据棕红色的深浅与同样处理的丙酮酸标准液进行比较，即可计算出酶的活性。其反应过程如下：
King 氏法谷丙氨酸转氨酶活性单位：每毫升血清在37℃与PH7.4的基质液作用60min，生成1μmol 丙酮酸为一个单位。临床检验取血清量为0.1mL, 报告数据以100mL血清计算，因此实际测得结果乘1000即可。例如0.1mL丙酮酸标准中丙酮酸含量为0.2μmol,即相当GPT200U/100ml血清。
试 剂 与 器 材
一、 样品
组织液或血清。
二、试剂
1． 甲液（1/15mol/L 磷酸氢二钠溶液）
称取磷酸氢二钠9.47g或含水磷酸氢二钠23.87g溶于蒸馏水中定容至1000ml.
2. 乙液(1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液)
称取磷酸二氢钾9.078g溶于蒸馏水中.定容至1000ml.
取甲液825ml,乙液175ml混合,此液pH应为7.4.
3. GPT基质液
称取α-酮戊二酸29.2mg(2m mol/l)及α-DL-丙氨酸1.78g(200 m mol/l) 溶于50mlpH7.4的磷酸缓冲液中,加0.1mol/L NaOH溶液约0.5mL,调节pH为7.4,然后加磷酸缓冲液定容至100mL.加少许氯仿防腐,置冰箱中保存.
4. 2,4-二硝基苯肼(1 m mol/L)
称2,4-二硝基苯肼20mg. 先溶于10mL浓盐酸中,使其溶解.再以蒸馏水定容至100mL.
5. 丙酮酸标准液
精确称取丙酮酸钠22mg.加磷酸缓冲液后定容至100 mL.此液浓度为2μmol/mL, 临用前配置制.
0.4mol/L NaOH溶液,1/15 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.4).
三、 器材
试管及试管架，移液管（0.5mL,1mL,5mL）,量筒(10mL,100mL), 恒温水浴,722型分光光度计,坐标纸.
操 作 方 法
一、制备标准曲线
取12支试管，按下表操作作平行管：
试管编号
试剂处理 空白管 测 定 管
1 2 3 4 5
丙酮酸标准液/mL - 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
基质液/mL 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25
磷酸缓冲液/mL 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
各管摇匀后,置37℃水浴,保温10min
2,4-二硝基苯肼/mL 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
各管摇匀后,置37℃水浴,保温20min
0.4mol/LNaOH/mL 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
充分摇匀后,在30min内,520nm波长下比色
相当丙酮酸实际含量/μmol
- -
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50
相当GTP单位/100mL血清
- -
100 200 300 400 500
各管光吸收A520值
各测定管减空白A520值差
二、 绘制标准曲线
以光吸收值为纵坐标，酶活性单位为横坐标，在坐标纸上绘制各测得A520值与对应的酶活性单位数的标准曲线。
三、 样品及回收率测定
取10支干试管，按下表平行操作：
试管编号
试剂处理
Ⅰ标准空白管 Ⅱ标准管 Ⅲ血清空白管 Ⅳ血清管 Ⅴ血清加标准管
血清/mL - - 0.1 0.1 0.05
磷酸缓冲溶液/mL 0.10 - - - -
丙酮酸标准液/Ml - 0.10 - - 0.05
基质液/mL - 0.50 - 0.50 0.50
各管摇匀后,置37℃水浴,保温60min
基质液 0.50 - 0.50 - -
2,4-二硝基苯肼/mL 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
各管摇匀后,置37℃水浴,保温20min
0.4mol/L NaOH/mL 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
充分摇匀后,在520nm波长下比色,以蒸馏水校正光吸收为零
各管A520值
各测定管减空白A520值差
四、 结果计算
1. 标准曲线测定法
根据样品管A520值(已减去空白管A520) 查标准曲线,即得每100mL血清中转氨酶活性单位数.
2. 标准管测定法
每次测定酶活性时,同时用丙酮酸标准液(2μmol/mL)0.1mL,平行操作,即按上表操作,不做标准曲线,测定A520,按公式计算:
样品管A520 Ⅳ - Ⅲ
标准管A520
Ⅱ- Ⅰ
GPT(U)/100mL 血清= ×200= ×200
用本法测得人血清GTP正常值为91±35.8(U)/100mL血清.
3. 计算回收率
回收率% = 实际测得值(样品加标准测得值) ×100
理论计算值[（样品+标准计算值）/2] |
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