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[求助]
求操作常识
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求做HPLC，LC-MS的常识性资料，细节性的东西，比如说流动相的瓶子要放在固定的位置这方面的，我经常犯错误，现在做起实验来心惊胆战的，因为以前没有做过HPLC，所以继续这些资料，求各位大哥大姐能够帮帮我，真的很谢谢！！谢谢！ [ 来自科研家族 药物制剂 ] |
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 色谱分析 常用知识 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西湖醉鱼(金币+5): 感谢你提供的资料，欢迎常来 2012-01-05 18:56:48
TLC菜鸟(金币+3): 2012-03-13 23:00:52
感谢参与，应助指数 +1
西湖醉鱼(金币+5): 感谢你提供的资料，欢迎常来 2012-01-05 18:56:48
TLC菜鸟(金币+3): 2012-03-13 23:00:52
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转载一些，希望对你有用： 色谱柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 ① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。 ② 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 ③ 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 ④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 ⑤ 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。 ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50~75ml。 下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100~200µl四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。 阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。 ⑦ 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 ⑧ 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。 在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。 柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。 通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2~9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。 每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。 |
7楼2012-01-05 18:43:19
kukoob
铁杆木虫 (知名作家)
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2楼2011-11-07 00:08:13
张鑫1982
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3楼2011-11-07 11:26:09
hurrican120
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【答案】应助回帖
TLC菜鸟(金币+10): 谢谢！这个肯定是你的经验，非常谢谢你的教导。 2011-11-07 23:08:26
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给你讲讲一点吧： 流动相： 流动相一定要过滤干净，最好用色谱纯；确认你的柱子能够使用该流动相；比例要准确，这个是重复性好的重要一点；摆放位置不要在阳光和温度高的地方，最好屋子有恒温恒湿。 色谱柱： 色谱柱的知识要知道，哪些流动相、多少酸碱性、多少极性可以进入；换柱子的时候不要装反了；做实验的时候记得开恒温系统；不用的柱子一定要用流动相注满封口保存，不能干放。 检测器： 你的机器有什么检测器，检测原理是什么，你的东西能不能用这个检测器检测？检测器的设定条件，比如你是紫外可见，那波长应是多少？ 一般操作： 进样方式要正确，注意先后顺序；一定要等基线平稳后才能进样；时刻关注管路是否有气泡存在；时刻关注压力是否在合理数值，太高太低都有问题的；注意清洁卫生，用完就打扫桌面，擦灰尘。 分析方法： 最好有可靠文献支持，不要乱用。经验多了就可以自己摸索方法了。 纯手打，非复制粘贴！ |
4楼2011-11-07 16:52:25
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