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YJD落叶梧桐

新虫 (小有名气)

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应助: 5 (幼儿园)
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【答案】应助回帖

lcf004(金币+60): 很详细，不过本人没做过这方面的，第九步省了会有什么影响？我买的DNase I和RNase A都是固体，怎么称啊？谢谢你，上次也是你帮我解决问题的 2011-11-04 19:41:36
scelab(MicEPI+1): 鼓励下热心的朋友 2011-11-04 23:52:14

噬菌体PaP2粗制颗粒的提取
（1）挑宿主菌PA2单个菌落，接种于100ml液体LB培养基中，37℃、160rpm振荡培养至对数生长期早期；
⑵加入噬菌体单个噬斑，37℃160 rpm振荡培养过夜；
⑶在培养物中加入DNase I及RNase A至终浓度各为1μg/ml，37℃×30min；
⑷按1%的比例(v/v)加入氯仿，37℃×30min；
⑸按5.84g/100ml加入NaCl，混匀溶解，冰浴1h，10000g离心10min，收集上清
⑹加入固体PEG 8000至终浓度10%(w/v)，充分振荡溶解，冰浴1h，使噬菌体
颗粒形成沉淀，4℃12000g离心10min，弃尽上清；
⑺按每100ml原始菌液加2ml的比例，加入TM液混悬沉淀；
⑻加等体积氯仿，振荡30 sec，离心5000g×10min，收集上层水相；
⑼再用等体积氯仿抽提1次，得到噬菌体PaP2的粗制颗粒。
噬菌体PaP2基因组DNA的制备
1.在纯化的噬菌体PaP2颗粒中加入DNase I至终浓度5μg/ml，RNase A至1
μg/ml，37℃温育1h，以降解残留的宿主菌来源的DNA及RNA。
2.加入EDTA(pH8.0)至终浓度20mmol/l，灭活DNase I。
3.加蛋白酶K至终浓度50μg/ml，SDS至终浓度0.5%，混匀，56℃×1h，裂解
噬菌体。
4.用等体积平衡酚(pH8.0)抽提，5000g离心10min，收集上层水相。
5.用等体积氯仿再抽提一次，5000g离心10min，收集上层水相。
6.加入1/10体积3mol/l NaAc(pH5.2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，-20℃
1h或过夜，4℃、12000g离心20min。
7.沉淀分别用70%乙醇和无水乙醇洗涤一次，4℃、12000g离心10min，去乙醇，
室温晾干沉淀。
8.用适量TE溶解沉淀，获得基因组DNA样品。
9.CTAB抽提法去除DNA样品中的多糖：在600μl样品中加入100μl 5mol/l NaCl，
充分混匀，再加入80μl 10%CTAB/0.7mol/l NaCl液，混匀溶解，65℃温育10min；加
等体积氯仿，振荡混匀，12000g离心5min，收集上清；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇
(25∶24∶1)，振荡混匀，12000g离心5min，收集上清。加入终浓度0.3mol/l NaAc和
两倍体积的无水乙醇沉淀；4℃12000g离心10min；沉淀用70%乙醇和无水乙醇各洗
涤一次，去乙醇，空气中干燥沉淀。
10．用适量TE混悬沉淀，GeneQuant核酸定量仪上定量，分装后于-20℃保存。

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2楼2011-11-04 18:33:57

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