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mYang88

新虫 (初入文坛)

[求助] 多个亚基蛋白 ORF串联表达

请问：4个亚基的蛋白  ，4个ORF可否串联在一起 构建一个重组子表达

如果可以，那么
（1）ORF之间是否需要添加其他序列
（2）4个ORF共用一个启动子会不会影响表达效率
（3）每个ORF都要保留有完整的其实种子密码子么
（4）构建重组子时应注意哪些问题

不胜感激！
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1楼 2011-11-01 10:35:45
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mYang88

新虫 (初入文坛)
纠正。。。。（3）每个ORF是否需要保留完整的终止密码子
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2楼2011-11-01 10:36:51
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-11-01 19:53:45
只做过2个ORF的。。。
（3）终止密码子只保留最后一个ORF的，前面3个的去掉，不然后面的没法翻译。
（4）最需要注意的就是阅读框，因为克隆过程中会引入多余的序列，所以设计时就必须考虑阅读框，避免密码突变。
做得不多，只能说这么点了，等高人吧。
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3楼2011-11-01 17:16:17
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mYang88

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-01 17:16:17:
只做过2个ORF的。。。
（3）终止密码子只保留最后一个ORF的，前面3个的去掉，不然后面的没法翻译。
（4）最需要注意的就是阅读框，因为克隆过程中会引入多余的序列，所以设计时就必须考虑阅读框，避免密码突变。 ...

可是如果中间的终止密码子去掉翻译出来不就成了一条肽链么？
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4楼2011-11-01 17:59:28
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-11-02 14:51:12
引用回帖:
4楼: Originally posted by mYang88 at 2011-11-01 17:59:28:
可是如果中间的终止密码子去掉翻译出来不就成了一条肽链么？

每个蛋白都有自己的起始密码子，转录的时候得到一条mRNA，但是翻译时候还是能得到4个蛋白的吧。我经常做的是把GFP连在一个蛋白的后面，克隆的时候需要把前面这个蛋白的终止密码子去掉的。
不过你要4个蛋白一起，感觉有难度呢。
我做的不是很多，共同学习哈！
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5楼2011-11-01 18:06:15
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mYang88

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-01 18:06:15:
每个蛋白都有自己的起始密码子，转录的时候得到一条mRNA，但是翻译时候还是能得到4个蛋白的吧。我经常做的是把GFP连在一个蛋白的后面，克隆的时候需要把前面这个蛋白的终止密码子去掉的。
不过你要4个蛋白一起， ...

么的办法。。。蛋白就四个亚基。。。
谢谢~
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6楼2011-11-01 20:47:03
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lwq652

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4, MolEPI+1): 很好,很热心!授予专家指数一枚! 2011-11-12 10:01:16
把stop codon 去掉是可以的，这是融合表达，GFP是用来做报告基因的，但是我感觉楼主需要的是翻译的蛋白还能组装，所以建议如果做融合表达的话在两蛋白之间加一柔性linker
当然也可以做单promoter的表达，一个promoter，基因不去除stop codon，在第二个基因之前加RBS序列

呵呵，最简单的是一个promoter加一个基因。后面再一个promoter加一个基因，才四个嘛，怕什么，人家基因组都组装起来了
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一念错，便觉百行皆非，防之当如渡海浮囊，勿容一针之罅漏
7楼2011-11-11 23:25:01
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lwq652 at 2011-11-11 23:25:01
把stop codon 去掉是可以的，这是融合表达，GFP是用来做报告基因的，但是我感觉楼主需要的是翻译的蛋白还能组装，所以建议如果做融合表达的话在两蛋白之间加一柔性linker
当然也可以做单promoter的表达，一个promo ...

我想请教一下LINKER的设计和选择问题：
何时选取刚性的LINKER?何时选柔性的？

一般通过什么办法添加LINKER？？
报道的OVERLAP PCR法似乎有许多反应效率不高的问题
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8楼2013-07-11 00:13:42
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
我想请教一下LINKER的设计和选择问题：
何时选取刚性的LINKER?何时选柔性的？

一般通过什么办法添加LINKER？？
报道的OVERLAP PCR法似乎有许多反应效率不高的问题
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9楼2013-07-11 00:13:57
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-01 17:16:17
只做过2个ORF的。。。
（3）终止密码子只保留最后一个ORF的，前面3个的去掉，不然后面的没法翻译。
（4）最需要注意的就是阅读框，因为克隆过程中会引入多余的序列，所以设计时就必须考虑阅读框，避免密码突变。
...

第一个问题：我也要做两个基因的串联，你说的只留最后一个orf的终止密码子，你是用的“启动子+基因1+基因2+终止子”这种模式，还是第二种“启动子1+基因1+终止子1+启动子2+基因2+终止子2”这种吗？
第二个问题：原核表达一般不都是只需要成熟肽序列转入表达载体进行表达吗，我要做的蛋白ai包含两个亚基，a和b,我能不能直接把两个亚基的成熟肽序列转入表达载体进行表达，两个亚基的串联顺序如何，哪种串联方式，要不要加多余的序列，设计酶切位点引物的时候要不要考虑这个问题，我用的表达载体是pet32a



跪谢大神
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
10楼2015-08-19 16:33:21
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