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donnafeng

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白透析沉淀

预测的重组蛋白等电点是6.75     分子量约17kd        蛋白过ni柱后透析  用的是ph7.5的50mMtris-hcl缓冲液过夜 结果出现絮状的沉淀     
1.可能是等电点沉淀吗？看见有人说要偏离等电点2-3个单位 是这样的吗 改成ph8.5的tris-hcl缓冲液会不会好点呢
2.有可能是聚合沉淀吗  文献报道这种蛋白可能是二聚体或者四聚体 会不会在透析的过程中2、4、6、8聚体一类的都可能形成啊   如果是应该怎么处理
3.不用透析用柱层析来脱盐行吗  具体用什么柱子 什么条件来脱盐  看见有人用g-25来做脱盐柱  是不是不管多大的蛋白都可以用g-25脱盐啊   脱盐柱的原理是什么啊
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1楼 2011-10-27 09:51:30
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wolaiyefeng

铁杆木虫 (小有名气)
在等电点是会聚集沉淀的，这应该是纯化的方法吧，可以试下改PH值。
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2楼2011-10-27 11:52:58
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chaijudi

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5, MolEPI+1): 鼓励应助！ 2011-10-27 20:48:31
donnafeng(金币+40): 谢谢 实验室只有superdex75了 可以用来脱盐吗 蛋白17kd左右 疏水聚合可以加表面活性剂一类的减少吗 2011-10-28 10:11:57
donnafeng(金币+10): 2011-10-28 22:24:13
1.可能是等电点沉淀吗？看见有人说要偏离等电点2-3个单位 是这样的吗 改成ph8.5的tris-hcl缓冲液会不会好点呢
蛋白质带电荷的基团较多，pH酯有点影响，不会这么大吧！改变pH估计会有点效果，不会太大！

2.有可能是聚合沉淀吗  文献报道这种蛋白可能是二聚体或者四聚体 会不会在透析的过程中2、4、6、8聚体一类的都可能形成啊   如果是应该怎么处理
你看文献有研究和你类似的蛋白质没，有的话他们那些是否有聚合性质呢，。如果同类蛋白质多具有聚合性质，那估计你的蛋白质也具有这一性质。那可以考虑两个方面，一是加入电解质（也就是无机盐）减小聚合趋势（因电荷作用引起的）；另一个是疏水性作用引起的聚合，这个不太好办了！

3.不用透析用柱层析来脱盐行吗  具体用什么柱子 什么条件来脱盐  看见有人用g-25来做脱盐柱  是不是不管多大的蛋白都可以用g-25脱盐啊   脱盐柱的原理是什么啊
脱盐柱也可以，我用过G-25，原理就是无机小分子可以进入树脂的小孔内，在柱子经过的路径长，二蛋白质大分子则不能进入树脂内部，经由树脂间隙流出，由于两类物质所经历的途径长短不同，实现分离！

你观察到底聚合估计是由于溶液中的盐分减少，蛋白质间带不同电荷的基团相互吸引引起蛋白质分子沉降。
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3楼2011-10-27 14:23:08
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chaijudi

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chaijudi at 2011-10-27 14:23:08:
1.可能是等电点沉淀吗？看见有人说要偏离等电点2-3个单位 是这样的吗 改成ph8.5的tris-hcl缓冲液会不会好点呢
蛋白质带电荷的基团较多，pH酯有点影响，不会这么大吧！改变pH估计会有点效果，不会太大！

2.有可 ...

那个材料没用过，你看一下他的说明就是了！
表面活性剂不一定，好像是在一个pull-down实验了，本来两种蛋白质相互作用不是太明显，加入TritonX-100后，实验现象明显了。
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4楼2011-10-28 14:03:09
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