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C-JingX

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化问题

求助:包涵体纯化,方法是镍柱亲和层析,问题是每次蛋白都在洗杂蛋白时被洗下来,尝试了很多方法,不知道怎么优化?还有个疑问是,组氨酸只有6个,但目的蛋白有100多KDa,会不会是因为蛋白太大,6个组氨酸与镍柱的亲和力无法承受这么大蛋白,就像常用的粘钩一样,挂太重的东西就会直接掉下来呢???
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edoz1986

新虫 (小有名气)

可以采用带20mm咪唑长时间孵育柱子的方法。如果你有散装镍柱的话,平衡一部分,加入到破碎上清里面,可以加搅拌子搅拌,也可以放要摇床里面摇,一般一个小时就可以了。分子量太大,可能你的标签暴露不充分。
14楼2013-05-23 09:59:00
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

C-JingX(金币+1): 如果是不能结合的话,那上样的时候就应该直接流出来了啊,怎么还会在杂蛋白里面呢?? 2011-09-26 10:01:45
组氨酸部分可能碰巧被包裹在了蛋白的内部导致无法结合
2楼2011-09-25 19:32:18
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丙氨酸密码子

新虫 (小有名气)


wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-09-26 22:59:53
我现在还没做到这一步呢,哎,,我还在艰难的徘徊在PCR上面,提RNA,RT-PCR啊,,, 郁闷啊。
3楼2011-09-25 19:48:32
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流! 2011-09-26 23:00:14
已经也碰到过几个蛋白是这种情况,无解。
你可以试试变性后纯化或复性后纯化,看有没有区别。
生物资源交流QQ群:1044518333
4楼2011-09-25 19:54:40
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