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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞胞浆内细胞核周围有黑点是什么情况呢？
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silicare

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+10, BioEPI+1): 难得看你码这么多字，看来给钱还是管用的~~ 2011-09-17 13:14:35
qinjie1211(金币+200): 谢谢您啊！ 2011-09-17 19:44:58
qinjie1211(金币+1): 环丙沙星可以杀支原体污染吗？ 2011-09-17 19:46:12
如果是怀疑支原体的话，最佳方法就是做个爬片，用hochest 33342 33258等核酸荧光染料染色，如果污染，支原体就会在细胞周围看到蓝色的荧光小点，如果没有，则只有细胞的细胞核显色

没污染的


污染的





举个例子：

DNA萤光染色法
·  原理︰利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。
·  测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。
·  待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作萤光染色。有些细胞易有萤光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。
·  特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。
·  缺点：有时仍会有萤光背景，影响判读。
材料︰
·  Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内，使用前过火灭菌﹚，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。
·  Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，细胞须先测试无污染。αMEM with 10%FBS ( medium for Vero cell)
配制试剂:
·  无菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。
·  Hoechst 33258 stock solution（100X）︰称取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。
·  Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。
·  mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。
·  固定溶液（fixative）︰冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合，使用前才配制。
步骤：
·  培养Vero细胞： Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。
·  在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以1~2x10^4 cells／ml培养于chamber slide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37℃, 5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。
·  接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养液（可将细胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。
·  将测试样品加入chamber slide内，培养5天后，进行Hoechst 33258的萤光染色观察。
·  以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液﹚，负反应对照组为Vero cell之新鲜培养基( αMEM +10%FBS)。
DNA萤光染色检测︰
·  取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干10分钟。
·  于每个well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置30 min。
·  吸掉Hoechst 33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mounting solution，并以盖玻片覆盖之。
·  以100x-400x萤光显微镜观察。打开水银光源10 min后，以UV激发光束(330～380 nm)之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。
结果判读︰
若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。


类似的资料网上还有很多，可以搜一下

PS：你的金币给的太多了
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11楼2011-09-17 10:56:05
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song-20060

木虫 (职业作家)

Gattuso

【答案】应助回帖

细胞不好产生的空泡
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此刻，你心里想起谁？
12楼2011-09-17 15:34:52
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linerman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是不是培养基的沉淀结晶？
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13楼2011-09-17 16:09:44
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linerman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是不是在孵箱放时间长了，培养基内一些成分形成的沉淀结晶物？
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14楼2011-09-17 16:13:58
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seuman1
15楼2011-09-17 16:40:34
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luckyspoony

木虫 (小有名气)

青椒

【答案】应助回帖

qinjie1211(金币+1): 没灭过活的，做免疫学实验才需要灭活的 2011-09-17 19:39:03
引用回帖:
1楼: Originally posted by qinjie1211 at 2011-09-15 19:52:55:
妊娠的滋养细胞，培养了两天左右发现胞浆内细胞核周围有一圈黑点，是营养不足还是支原体污染呢？血清绝对没问题，用的是以色列BioInd的特级胎牛血清，养其他细胞都很好的。请各位朋友支支招， ...

那这个黑点是否影响到细胞的生长了呢？还有你的胎牛血清在使用前是否有进行灭活过?我记得说：如果血清有进行灭活过会产生一些黑点类似物，这是因为血清灭活之后会使沉淀物增加，这些沉淀物在倒置显微镜下观察时会看到一些黑点物质。
这只是我个人浅解，不知道能否帮您理解~~~还有支原体污染貌似是看不见的，发生支原体污染的症状是细胞生长状态越来越差时可以怀疑支原体污染，具体是不是还要做细菌试验的~~~
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机会永远只垂青有准备的人！
16楼2011-09-17 17:27:46
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380218013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
1538636楼: Originally posted by dongfang5715 at 2011-09-17 09:43:04:
是不是二氧化碳不够了 然后细胞变坏了

你好：我想确认一下二氧化碳不够了，细胞中会产生黑点——可能会运动也可能是布朗运动型的。因为最近我的细胞中也出现这黑点了，很多 不知道如何控制 烦啊
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好好生活，努力赚钱
17楼2012-04-11 10:19:58
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gengfeng

新虫 (初入文坛)
我用的也是这个牌子的血清，然后是同样的问题，细胞内黑点比较多，然后不爱张慢慢的死去了！郁闷！！有人说是血清灭活后的产物不知道是不是！
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18楼2015-06-01 10:37:05
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走路的麻雀

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我培养的上皮细胞也是这样   我用了生长因子  不知道你用不用   我觉得可能是
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19楼2015-06-01 16:42:42
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