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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)

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[交流] 3‘RACE inner PCR 电泳结果总是有弥散现象回收条带不成带状什么原因啊？已有11人参与

采用65度退火温度跑两轮3‘RACE PCR 电泳条带多条，并且最大的条带上面很大的弥散带，用的是TAKARA 3‘RACE试剂盒，设计两条上游特异性引物相差117bp,设计原则按照说明书来的，想问问做过3‘RACE的前辈们，这到底什么原因啊？图1为pcr结果，图2为切胶回收结果。

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1楼 2011-09-09 09:10:34

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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫

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★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

不知道你跑胶的浓度和电压大小是多少？你可以跑得慢一点

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好好学习，天天向上

17楼2012-05-22 11:21:32

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linqin1029

新虫 (初入文坛)

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★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+3): Good！ 2011-09-09 16:33:02

怎么，我看不了你的图片啊！我提几点建议吧！
1、3‘RACE 的引物一般在60度以上，而且两条引物TM值要相差几度。以便改变两轮PCR的退火温度。
2、两轮巢式PCR的退火温度也要有差异，第二轮PCR退火温度要比第一轮高。以便减少非特异性扩增。
3、第一轮的PCR循环数25轮就OK拉，以便减少非特异扩增。
4、第一轮PCR的产物一般稀释5~20倍作为第二轮PCR的模板，以便减少非特异的产物模板。

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2楼2011-09-09 10:00:52

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