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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做枯草芽孢杆菌感受态用什么方法好？要详细步骤，谢谢
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wjb6681393

金虫 (小有名气)

[求助] 做枯草芽孢杆菌感受态用什么方法好？要详细步骤，谢谢

我看有的方法用的水解酪蛋白，用哪个公司的好？
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为了梦想……
1楼 2011-09-06 20:48:59
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铅钋锶钇

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): 很热心 2011-09-12 08:25:05
这是我在网上看见的，别人发的方法不知有用没，还没试呢

①取受体菌接种于BY培养液中，37℃培养到对数生长早中期。此时OD620应在0.4左右，培养时间约为4～5小时。
②将培养后的菌液离心，弃去上清液，再用生长培养基（GM液）洗菌一次，然后将菌体细胞重新悬浮在与BY培养液等体积的GM液中。37℃继续振荡培养到对数生长后期。此时OD620应在0.6～0.9，培养时间约为3～5小时。
③以1:10的比例将GM液中培养的菌液稀释于转化培养基（TM液）中。即取菌液0.2ml加入1.8mlTM液中，在20×150mm的试管中，37℃振荡培养90分钟。
④加入供体质粒，至最终浓度1ug/ml，于20×150mm的试管中，37℃振荡培养30分钟。
⑤取200ul涂布抗性选择平板，37℃培养48小时。
【培养基配方】
A.        BY培养基：牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖5g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
B.        1×最低盐溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4•3H2O 18.34g），K2HPO4 6g，(NH4)2SO4 2g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7•2H2O）1g，MgSO4•7H2O 0.2g，在蒸馏水中依次溶解，加水至1000ml。
C.        L- trp溶液，2mg/ml，贮于棕色瓶内，用黑纸包裹。（过滤灭菌）
D.        生长培养基：GM，使用时混合比例。1×最低盐溶液100ml，1M硫酸镁0.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，L-trp 50ug/ml。
E.        转化培养基：TM，使用时混合比例。1×最低盐溶液100ml，1M硫酸镁0.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.2ml，L-trp 5ug/ml。

其中 50% 葡萄糖 过滤灭菌   5%水解酪蛋白和10%酵母汁均可高温灭菌
至于载体你可以试试 pAX01这是一个适用于芽孢杆菌属的过表达载体
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2楼2011-09-08 11:34:15
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good！ 2011-11-17 19:36:17
wjb6681393(金币+40): thanks 2011-12-09 19:14:42
1）接种B . subtilis于3mlLB培养基中，过夜培养.。

2）取2.6ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培养至OD600=0.85~0.95.

3）将菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃离心收集菌体。

4）用50ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖），重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次。

5）将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中，每EP管分装120。

6）将60μl感受态细胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。

电转仪设置：2.0kv,1mm,电击1次。（电击结果：时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2 ,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率）

7）电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。

准备 40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l , 酵母粉5g/l , NaCl 10g/l , 3.6g山梨醇pH=7.2

200ml电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，20g葡萄糖。

10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。 2个50ml离心管，灭菌。

我做芽孢杆菌电转化 这个是之前大神告诉我的方法
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3楼2011-11-17 17:05:21
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银杏酸酸

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shuangzi8761 at 2011-11-17 17:05:21
1）接种B . subtilis于3mlLB培养基中，过夜培养.。

2）取2.6ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培养至OD600=0.85~0.95.

3）将菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃离心收集菌体。 ...

请问你做出来了吗
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4楼2014-01-10 16:59:42
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银杏酸酸

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shuangzi8761 at 2011-11-17 17:05:21
1）接种B . subtilis于3mlLB培养基中，过夜培养.。

2）取2.6ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培养至OD600=0.85~0.95.

3）将菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃离心收集菌体。 ...

你好，最近在做枯草感受态，能和你聊一聊吗？
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5楼2014-01-11 22:16:43
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 银杏酸酸 at 2014-01-11 22:16:43
你好，最近在做枯草感受态，能和你聊一聊吗？...

Q：745933902
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6楼2014-01-13 16:58:37
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xissy

铜虫 (小有名气)
最后的RM应该是：LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇，吧？
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7楼2014-02-11 13:38:03
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