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syn1985

木虫 (正式写手)

[求助] 关于链霉菌文库筛选的困惑 真的好纠结啊

前一段时间在一家公司建了链霉菌的fosmid基因组文库,现在在用自己的特定引物筛选含有目的基因的克隆,筛选发现这个基因几乎是每个保菌板(384孔板)里面都有,我在第一个384孔板里就筛到了6个阳性克隆,其他的都不知道怎么办了,实在是太多了。
这个基因是合成一类化合物里面的一个比较保守的基因,现在我在纠结,因为一个克隆测序要花1-2万,不可能把所有的都测序,但是如果吧所有的都找到然后挑选也很麻烦,因为实在是太多,可是又纠结于自己从已经筛到的6个克隆里面挑一个万一不是我目的化合物的基因那可怎么办?
不知道哪位虫子有好点的主意 ,小妹在此谢过
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

syn1985(金币+3): 谢谢 2011-09-02 16:25:17
设计探针,做Southern 杂交
2楼2011-09-02 14:45:05
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syn1985

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-09-02 14:45:05:
设计探针,做Southern 杂交

我没做过杂交 我有点不明白这杂交的结果会和我PCR的结果有多大的差别呢?
3楼2011-09-02 16:25:51
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

syn1985(金币+7): 5 2011-09-03 15:53:54
PCR不一定很准确的,会出现假阳性的情况,Southern杂交的话你可以去看一下有关的文献,像做基因调控的学者一般都是用这种方法筛选到自己的目的基因的。
4楼2011-09-02 20:31:50
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syn1985

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-09-02 20:31:50:
PCR不一定很准确的,会出现假阳性的情况,Southern杂交的话你可以去看一下有关的文献,像做基因调控的学者一般都是用这种方法筛选到自己的目的基因的。

但是我的克隆太多 有2万个 如果做southern的话成本高和效率低 两者结合应该不错吧
5楼2011-09-03 15:53:47
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

Southern杂交效率很高的。
6楼2011-09-03 18:25:17
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

fosmid 末端测序..
7楼2012-06-12 20:03:37
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shuhua759

捐助贵宾 (著名写手)

先多筛一些,然后提取fosmid质粒,酶切分析各fosmid的关系。然后选择代表性的fosmid进行末端测序。同时先可以敲除这个基因,以验证其的作用。
8楼2012-06-21 18:26:48
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syn1985

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4609740楼: Originally posted by shuhua759 at 2012-06-21 18:26:48
先多筛一些,然后提取fosmid质粒,酶切分析各fosmid的关系。然后选择代表性的fosmid进行末端测序。同时先可以敲除这个基因,以验证其的作用。

我已经做完了 谢谢
9楼2012-06-21 20:21:44
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Z_Eira

新虫 (初入文坛)

想问楼主一个小白的问题,怎么减少384孔板里复孔间的差异啊
10楼2016-10-16 19:46:19
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