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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于SiRNA表达载体构建的问题
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dxhly

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于SiRNA表达载体构建的问题

请各位高人指点一下，我在构建SiRNA表达载体时遇到一个问题，在酶切空载体凝胶电泳胶回收纯化后，线性载体与目的片段按1:10的比例进行连接，转化DH5a感受态细菌后，在含卡那霉素的培养板上能够长出多个单菌落，但是每次提取质粒鉴定时，所提取的质粒远大于8.8Kb左右的目的质粒（见图）。做了很多次都是这样，很郁闷，只有一次构建成功并测序正确。所用的试剂盒：Sfi-I限制性内切酶、T4连接酶为NEB,胶回收纯化试剂盒为PROMEGA。

望各位高人指点，不胜感激！
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1楼 2011-08-21 20:15:57
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 您的意见呢？ 2011-08-22 12:05:11
dxhly(金币+2): 2011-08-29 23:28:03
只用了一个酶切位点的话质粒自连的几率比较大，情况也比较复杂。
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2楼2011-08-22 09:57:43
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dxhly

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ganchao1776 at 2011-08-22 09:57:43:
只用了一个酶切位点的话质粒自连的几率比较大，情况也比较复杂。

是双酶切位点
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3楼2011-08-25 23:20:10
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
那就不清楚了
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4楼2011-08-26 00:43:31
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rengang666

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-08-26 17:12:34
dxhly(金币+2): 2011-08-29 23:28:12
估计是载体污染了，你再重新鉴定一下原载体，重新划线！！
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5楼2011-08-26 10:47:24
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李禄慧

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-08-30 18:50:04
siRNA载体的构建本身就有一些难度，你首先要确定你的载体有没有问题，我觉得你的之重组质之所以连接不上，大部分原因还是在于载体没有处理好。你的目的片段回收如果是正确的。那么一定要确保载体不要回收放置时间过长，载体相应用量要少，回收片段相应多点。1:6你试试。还有就是回收回来的东西不要有污染，换个回收试剂盒看看。
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6楼2011-08-30 09:49:52
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dxhly

铜虫 (初入文坛)
谢谢你们！
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7楼2011-08-31 15:20:35
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辉辉集团

银虫 (正式写手)
支持下吧
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8楼2011-08-31 17:00:10
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qincaifan

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): 鼓励新虫！鼓励交流！ 2011-09-23 09:16:29
我也出现过这样的情况。可能是质粒污染吧，再重做一次试试
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9楼2011-09-23 09:12:02
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三轮123456

新虫 (初入文坛)
你可以重新提质粒酶切，尽量使质粒酶切完全。
可以委托北京英茂盛业生物公司做载体构建，他们很有经验。
http://www.inovogen.com/cp/shRNAvector/
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10楼2012-03-09 10:39:09
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