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liuliancy铁杆木虫 (正式写手)
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离子交换层析（deae-纤维素）出峰差异很大（有图谱）
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昨天用DEAE-纤维素过柱子，图谱如1，目标蛋白跟杂蛋白差没分开，今天用相同的缓冲液相同的上样量和样品，结果却一点都没分开，柱子1*20，上样2ml，梯度洗脱液为50mL 20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，得到的图谱却是2和3的样子，请教各位长辈这是为什么？洗脱液要怎么调节才能将得到较好的洗脱效果？ 图1  图2  图3  [ 来自科研家族 生物医药家族 ] |
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liuliancy
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19楼2011-08-25 09:38:11
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【答案】应助回帖
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adslye(金币+2, BioEPI+1): 鼓励经典~祝顺利！ 2011-08-18 09:20:19
liuliancy(金币+3): 感谢老大！！！ 2011-08-18 09:27:20
adslye(金币+2, BioEPI+1): 鼓励经典~祝顺利！ 2011-08-18 09:20:19
liuliancy(金币+3): 感谢老大！！！ 2011-08-18 09:27:20
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1、我没听说过Tris-醋酸这个缓冲液，你有没有试过Tris-盐酸缓冲液？ 2、你的两个洗脱液用的是20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，看来你是想用pH梯度和离子强度一起来制造一个洗脱梯度，这样做有什么依据吗？我认为这样会引入误差，因为两个因素制造的梯度可控制性可能会弱于一个因素。如果用pH值，不知道稍低的pH值会不会引起蛋白质失活，所以我喜欢用离子强度作为洗脱梯度，起始缓冲液和洗脱缓冲液的pH值相同，但是氯化钠分别为0和1M，能制作出一条从0-1M的连续线性梯度。这样结果也更好分析。 3、两个峰即使是顶点能分开，但交叉很大也是不纯的。DEAE在我的实验里分离效果差，比不上其它的阴离子交换层析柱，如果有别的层析柱，也可以联用。 4、层析柱1*20没有意义，计算柱体积才有意义。 |
2楼2011-08-18 00:06:28
liuliancy
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