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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 离子交换层析（deae-纤维素）出峰差异很大（有图谱）
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liuliancy

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 离子交换层析（deae-纤维素）出峰差异很大（有图谱）

昨天用DEAE-纤维素过柱子，图谱如1，目标蛋白跟杂蛋白差没分开，今天用相同的缓冲液相同的上样量和样品，结果却一点都没分开，柱子1*20，上样2ml，梯度洗脱液为50mL 20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，得到的图谱却是2和3的样子，请教各位长辈这是为什么？洗脱液要怎么调节才能将得到较好的洗脱效果？
                             图1

                                                  图2

                                                  图3


[ 来自科研家族 生物医药家族 ]
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1楼2011-08-17 20:54:08
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+8, BioEPI+1): 辛苦了 2011-08-20 09:55:45
liuliancy(金币+3): 收到！！！老大辛苦了...一定要成功！！！一切皆有可能！！！！ 2011-08-20 10:53:49
你的主要峰大概为三个，但是第一个峰是非常靠近0点，说明有很多弱吸附的蛋白质，这些蛋白质可能会被起始缓冲液冲洗下来，现在你没有平衡步骤，所以有可能会影响吸附得稍微强一些的蛋白质出峰，造成蛋白质的重叠。假如加入平衡步骤，你的第一个峰可能高度会下降一些，峰形状可能也会有所变化。这仅是分析，由于你的蛋白质在后面出来，所以第一个峰无论怎样都不要紧，所以我认为除非你的蛋白质较前出来才要平衡，现在你不用平衡也可以，虽然得不到本来的峰形状，但没关系。

从图2（20mM tris-hcl ph7.5和20mM tris-hcl ph7.5（含NaCl 1M））看出，你的蛋白质在中间稍前出来，此时的电导率约为35-40%，所以我推测你的蛋白质等电点约为5.0-5.5。

假设你的四次实验的样品上样量一样，那么可以初步从峰的高度来推测所受蛋白质干扰的程度。图1的峰高度最低，推测含有杂质蛋白质最少。与其它峰之间构成的峰谷高度（主要为第二个峰）也能指示蛋白质之间的分离效果，虽然图4最小为0.12，但是峰3过高，说明杂质蛋白质极多；虽然图3较小为0.35，但是峰1过细，难以断定峰1右侧的小峰是否为峰2，而目的蛋白质所在的峰左侧有不平滑处，有可能是峰2，所以可能峰3收到了峰2的干扰；图2中峰形状最好，三个峰之间很明显能分开，分离效果我觉得较好；图1中虽然峰2和3之间分得不开，但峰3的高度是最低的，说明杂质蛋白质可能较少，同时峰2、3之间隐约有个不算太明显的小峰，因为峰2、3的高度较矮，所以可能是属于峰2、3的蛋白质有些被合并到中间去了。

综上所述，我觉得分离效果由好至差可能是1、2、3、4，但是2比1可能稍差而不是差得很明显，建议选用1，2作为备用。同时将四次层析有酶活力的收集管跑SDS-PAGE，依据蛋白质条带来确认分离效果。由于是第一步纯化，可能蛋白质条带较多，但是可能可以推测。

生物学实验一切皆有可能，所以我只说可能。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
12楼2011-08-20 05:36:20
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2, BioEPI+1): 鼓励经典~祝顺利！ 2011-08-18 09:20:19
liuliancy(金币+3): 感谢老大！！！ 2011-08-18 09:27:20
1、我没听说过Tris-醋酸这个缓冲液，你有没有试过Tris-盐酸缓冲液？

2、你的两个洗脱液用的是20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，看来你是想用pH梯度和离子强度一起来制造一个洗脱梯度，这样做有什么依据吗？我认为这样会引入误差，因为两个因素制造的梯度可控制性可能会弱于一个因素。如果用pH值，不知道稍低的pH值会不会引起蛋白质失活，所以我喜欢用离子强度作为洗脱梯度，起始缓冲液和洗脱缓冲液的pH值相同，但是氯化钠分别为0和1M，能制作出一条从0-1M的连续线性梯度。这样结果也更好分析。

3、两个峰即使是顶点能分开，但交叉很大也是不纯的。DEAE在我的实验里分离效果差，比不上其它的阴离子交换层析柱，如果有别的层析柱，也可以联用。

4、层析柱1*20没有意义，计算柱体积才有意义。
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2楼2011-08-18 00:06:28
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liuliancy

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-08-18 00:06:28:
1、我没听说过Tris-醋酸这个缓冲液，你有没有试过Tris-盐酸缓冲液？

2、你的两个洗脱液用的是20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，看来你是想用pH梯度和 ...

感谢老大了！！不过Tris-醋酸我也是第一次听说，一个文献上的洗脱条件，这些东西也都是第一次用所有很多不太了解，用Tris-Hcl氯化钠分别为0和1M梯度试试，不知道老大能不能推荐几个阴离子交换层析柱，我做的是SOD（超氧化物歧化酶），再次感谢！！
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3楼2011-08-18 09:35:05
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alexlv

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
liuliancy(金币+1): 不要盯着一个柱子？难道要几个一起？ 2011-08-18 13:16:05
adslye(金币+1): 感谢交流~祝顺利！ 2011-08-18 19:22:52
控制好洗脱梯度和体积，以及PH，当然不要盯着一个柱子。
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4楼2011-08-18 12:06:14
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