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jian520yi

木虫 (正式写手)

[求助] 一个合成的约40bp的片段怎么引入载体?

如题,我需要在载体中加入一个纯化标签,标签两边酶切位点和载体一样,但标签是合成的小片段,40bp,怎么做?就用合成片段来扩增吗? 麻烦高手指点!
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成功源自于不断的努力和坚持
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decloud

木虫 (著名写手)

引用回帖:
967041楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-04 20:28:23:
技术路线很简单,引物回来稀释成100pmol/ul
两条各取2ul混匀成4ul,95度变性5min,慢退火(PCR 95度反应后直接停止关机,30分钟后拿出来放在室温)

连接体系就是4ul小片段+载体(能达到300ng最好)+T4buff ...

我也有个问题::::举手~~~~~~

我要导入的也是40bp,但是我要导入的那种含外援基因的的质粒的3端只有一个酶切为点...我准备设计互补含粘性末端的双链...但是一个位点,我没法确定方向啊....
适则存乙,劳则忙乙,
12楼2012-03-25 04:26:28
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查看全部 13 个回答

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
jian520yi(金币+4): 非常感谢! 2011-08-04 19:24:19
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利! 2011-08-05 19:25:26
你合成的是双链,还是用两条引物退火而成
http://edu.muchong.com/attachment/9c/48/654839_1299721150_644.jpg
可以利用两个引物退火形成带粘端小片段,然后和载体连接
2楼2011-08-04 19:08:59
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jian520yi

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-04 19:08:59:
你合成的是双链,还是用两条引物退火而成
http://edu.muchong.com/attachment/9c/48/654839_1299721150_644.jpg
可以利用两个引物退火形成带粘端小片段,然后和载体连接

我还是有很多地方感觉不清楚,比如合成约25bpy引物,后面是用类似PCR的方法使其扩增?那酶,DNTP什么的要怎么解决?这么小怎么纯化?连接也会比较难呀。
成功源自于不断的努力和坚持
3楼2011-08-05 09:39:26
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
jian520yi(金币+6): 谢谢 2011-08-05 10:58:04
adslye(金币+3): 鼓励交流~祝顺利! 2011-08-05 19:25:52
不要扩增直接退火啊,你合成的引物浓度很高的,不用PCR扩增的
4楼2011-08-05 10:26:17
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