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boymin2010

金虫 (正式写手)

[求助] PCR求助~

最近遇到疑难问题如下,请教各位大虾~不甚感谢
我的部分实验步骤如下:酶切基因组后割胶回收500~1000bp的片段,加上22bp的接头后用这个接头进行pcr验证连接效果。
问题:1、序号为107和114的泳道怎么会出现300~500bp大小的pcr产物?
      2、割胶回收的酶切产物基本集中在1000bp左右,为什么pcr产物主要集中在500bp左右?
*makerTakara的DL505(100bp ladder),最亮的条带大小是500bp.


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boymin2010

金虫 (正式写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by linyanfei at 2011-08-05 08:53:59:
有可能你的接头引物在片段的其他部分还有碱基的配对,造成p出多个条带。而且你的退火温度明显还有待提高,拖带很明显的哦!

我的目标条带应该是500bp~1000bp之间的,关键点是出现了500bp以下的条带.提高退火温度后还是有类似的情况。
13楼2011-08-05 12:27:50
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taishanwei

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


boymin2010(金币+1): 2011-08-01 13:19:09
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-08-01 16:53:10
上面那张说明你没有链接成功。重新连看看。
2楼2011-08-01 13:12:40
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boymin2010

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by taishanwei at 2011-08-01 13:12:40:
上面那张说明你没有链接成功。重新连看看。

如果没有连接成功就P不出东西了,因为PCR引物就是接头哦~
3楼2011-08-01 13:18:39
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taishanwei

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): 鼓励 2011-08-01 16:53:24
你可以做个对照,拿空载体对你的引物左看看,看是不是有一样的结果。如果链接上的话,结果会非常明显,会在1000bp的位置出现条带、
4楼2011-08-01 13:24:54
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