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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 问一下蛋白表达中出现的问题~
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snowice

银虫 (小有名气)

[交流] 问一下蛋白表达中出现的问题~

最近在做蛋白表达跑电泳的时候总在目的条带附近出现一条比较拖尾的条带，其他区域条带都很正常，因为带his标签，所以WB砸了一下，发现诱导前、诱导后全菌、诱导后上清、沉淀均砸出条带，诱导前可能是表达泄露了，因为上清中太少，过了下柱子基本没东西，所以只能洗包涵体，现在想问下各位大牛箭头所指那条有点拖尾的条带是怎么回事，载体是pRSET-A，应该就是我的目的蛋白，因为换别的载体表达也在目的大小出现这样的拖尾条带，请问这影响我纯化吗，打抗体用？

图中从第二张图从左到右到第一张图为诱导前全菌、诱导4h全菌、上清、沉淀，一共挑了7个单克隆。
谢谢各位啦~~

[ Last edited by snowice on 2011-7-18 at 00:40 ]
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1楼2011-07-17 00:01:54
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yang0071

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-07-17 20:23:27
没看出你的目标蛋白在哪里
别跟我说是那个最下面的那条
那条是的可能性小，诱导前就有了
wb用的啥抗体，针对啥的
还有  photoshop学起来，起码标识要有
最起码 旋转180度这个总要吧，毕竟从左到右习惯了
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-07-17 07:53:23
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yang0071

木虫 (职业作家)
不好意思，his是哪个公司的，平常做其他his的话，那个带位置有杂带不？
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3楼2011-07-17 07:54:57
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snowice

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yang0071 at 2011-07-17 07:53:23:
没看出你的目标蛋白在哪里
别跟我说是那个最下面的那条
那条是的可能性小，诱导前就有了
wb用的啥抗体，针对啥的
还有  photoshop学起来，起码标识要有
最起码 旋转180度这个总要吧，毕竟从左到右习惯了

嗯 不好意思，昨晚发的太晚了 没来的及好好整 就是倒数第二条marker附近那条比较拖得带，我觉得可能就是那个，因为换了GST的大标签也会在预测的大小附近出现拖得更厉害的条带；诱导前有可能是表达泄露了吧，改天做个空质粒对照看看好了；
您能告诉我为啥那条带会拖吗，因为其他带都是正常的，所以有点不明白，蛋白酶抑制剂啥的都加了的；
his 的抗体是sigma的，应该没问题，砸出条带也很单一
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4楼2011-07-17 23:45:53
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snowice

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yang0071 at 2011-07-17 07:54:57:
不好意思，his是哪个公司的，平常做其他his的话，那个带位置有杂带不？

您好，图片已改，请问下疑似目的条带拖尾是怎么回事呢？多谢啦
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5楼2011-07-18 00:41:23
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yang0071

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
最好有wb的图作参考，更好判断一些
目前可能性，1   表达量不错，蛋白很多，所以拖尾
            2   产生剪切体，但是没有wb不好判断
不管哪种基本上  表达出来了
至于纯化，应该可以。
打抗体，未知。 存在于沉淀中，看你复性的情况了，打是可以打，就是出来是不是能用于wb还是ip的问题了
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6楼2011-07-18 08:33:53
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九字江山

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
原核蛋白表达纯化试验中，目的蛋白拖尾一般是有样品量过大或溶解效果不佳引起的，一般不会对实验结果造成影响；包涵体蛋白复性中His标签很小且免疫原性很低，可以直接打抗体。
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7楼2015-02-12 13:40:45
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九字江山

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我去ヾ(｡｀Д′｡，没注意，陈年老贴啊
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8楼2015-02-12 13:43:56
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