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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 跪求指点HPR与TMB的显色反应
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yun880305t

新虫 (初入文坛)

[求助] 跪求指点HPR与TMB的显色反应

本人最近在做HPR与TMB的显色反应实验，开始按照JACS上一篇文章配置TMB工作液（TMB用DMSO配成1mg/ml，然后与0.1M柠檬酸、0.2M Na2HPO4的混合溶液按1：9混和），这之后直接就出现了蓝色沉淀。然后第二次在网上寻求别人帮助找到一个TMB工作液配置方法（A液：Na2Ac 13.6g，柠檬酸1.6g，30%双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml。 B液：EDTA Na2 0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，取0.15gTMB溶于3mlDMSO中，蒸馏水加至500ml。使用时去A B等体积混合），这一方法发现当我直接用HEMIN与TMB工作液混合时，直接就变成了浅蓝色溶液（没有沉淀）。跪求哪位高手指点迷津，并且好心透漏下您亲自验证过的TMB工作液配置方法，感激不尽。
注：本人是化学专业的，做的并不是ELISA检验，只是需要TMB的显色信号。
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1楼 2011-07-14 12:54:18
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674406238wx

银虫 (小有名气)
请问你用的TMB是它的盐酸盐吗？我现在也想做这个实验
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6楼2013-05-13 11:35:46
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zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good！ 2011-07-14 16:52:10
yun880305t(金币+5): 谢谢你的帮助 先给你5个金币 新人ING 等我赚够了10个再给你5555 2011-07-15 00:34:22
不是显色液配方的问题，而是你的试剂中某个成分或多个成分被HRP污染了，而且看你的描述，污染应该还不轻。建议换掉所有的母液，重新配吧。配置这类试剂要十分小心，接触到的各类容器与耗材都要很干净，一定避免接触到HRP还有重金属。
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2楼2011-07-14 14:03:54
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yun880305t

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zsy1106 at 2011-07-14 14:03:54:
不是显色液配方的问题，而是你的试剂中某个成分或多个成分被HRP污染了，而且看你的描述，污染应该还不轻。建议换掉所有的母液，重新配吧。配置这类试剂要十分小心，接触到的各类容器与耗材都要很干净，一定避免接 ...

谢谢你的帮助....我开始也怀疑是不是被污染了 但是我后来直接用TMB的DMSO溶液加入Na2HPO4溶液也直接出现了蓝色沉淀，难道他们俩会反应？...很是苦恼啊，我不太懂生物实验方面，请问配置母液的容器与试剂除了高温杀菌之外还要其他特殊处理吗？
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3楼2011-07-15 00:30:15
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zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): 一并奖励，欢迎交流 2011-07-15 10:35:50
yun880305t(金币+5): 谢谢您的耐心解答，第一次碰DNA酶就遇到这问题 以后有阴影了~o~！ 2011-07-15 19:44:39
呵呵，金币无所谓了。而且看了你后面的补充描述，我有点质疑我之前的看法了。一个一个说吧。
1、在没有HRP存在的情况下，TMB可以被缓慢的氧化而逐渐呈色，但这个过程耗时挺长的，所以楼主说AB液混合后立即就显色并且有沉淀，我才怀疑是HRP污染了。
2、但后面你说的“直接用TMB的DMSO溶液加入Na2HPO4溶液也直接出现了蓝色沉淀”就比较奇怪了，因为即使TMB被HRP污染，但在无氧化剂的情况下，是不应该会有反应的。所以我也想不明白为什么会这样了。
3、配置溶液的容器主要是要干净，用超纯水多洗几遍。如果不涉及到生产，是否灭菌倒是无所谓。
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4楼2011-07-15 10:15:52
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