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yanhui8558

金虫 (小有名气)

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[求助] his标签蛋白纯化，不挂柱已有1人参与

我一直在用大肠杆菌表达一个蛋白激酶，用pet21a载体，用过超声破碎和先溶菌酶处理和超声处理破碎。结果蛋白主要在沉淀中，上清中的量不多但还可以，主要问题是不怎么挂镍柱，用PBS平衡柱子，PH8.0, 30mM咪唑洗杂蛋白，250mM咪唑洗脱，跑蛋白电泳和western都是穿过液和上清条带都差不多，很苦恼，

有没有高人指点一下啊。

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1楼2011-07-11 15:24:24

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101202139

铜虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 感谢参与 2011-07-18 22:53:21
yanhui8558(金币+1): 2011-07-19 15:05:56
yanhui8558(金币+1): 2011-08-02 09:45:04

引用回帖:

Originally posted by yanhui8558 at 2011-07-11 15:24:24:
我一直在用大肠杆菌表达一个蛋白激酶，用pet21a载体，用过超声破碎和先溶菌酶处理和超声处理破碎。结果蛋白主要在沉淀中，上清中的量不多但还可以，主要问题是不怎么挂镍柱，用PBS平衡柱子，PH8.0, 30mM咪唑洗杂蛋 ...

一方面提高可溶性的，对诱导条件进行摸索，如温度，诱导剂浓度。还可以尝试改变一下表达载体。另一方面进行纯化时，可以改变his tag的位置，也可以适当提高树脂的量，或者增大菌体量试一试。若是一点也纯化不出来，很有可能是his tag 被包埋在蛋白空间结构中，那建议还是利用变复性吧！