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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » his标签蛋白纯化，不挂柱
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yanhui8558

金虫 (小有名气)

[求助] his标签蛋白纯化，不挂柱 已有1人参与

我一直在用大肠杆菌表达一个蛋白激酶，用pet21a载体，用过超声破碎和先溶菌酶处理和超声处理破碎。结果蛋白主要在沉淀中，上清中的量不多但还可以，主要问题是不怎么挂镍柱，用PBS平衡柱子，PH8.0, 30mM咪唑洗杂蛋白，250mM咪唑洗脱，跑蛋白电泳和western都是穿过液和上清条带都差不多，很苦恼，有没有高人指点一下啊。
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1楼 2011-07-11 15:24:24
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101202139

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 感谢参与 2011-07-18 22:53:21
yanhui8558(金币+1): 2011-07-19 15:05:56
yanhui8558(金币+1): 2011-08-02 09:45:04
引用回帖:
Originally posted by yanhui8558 at 2011-07-11 15:24:24:
我一直在用大肠杆菌表达一个蛋白激酶，用pet21a载体，用过超声破碎和先溶菌酶处理和超声处理破碎。结果蛋白主要在沉淀中，上清中的量不多但还可以，主要问题是不怎么挂镍柱，用PBS平衡柱子，PH8.0, 30mM咪唑洗杂蛋 ...

一方面提高可溶性的，对诱导条件进行摸索，如温度，诱导剂浓度。还可以尝试改变一下表达载体。另一方面进行纯化时，可以改变his tag的位置，也可以适当提高树脂的量，或者增大菌体量试一试。若是一点也纯化不出来，很有可能是his tag 被包埋在蛋白空间结构中，那建议还是利用变复性吧！
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10楼2011-07-18 22:22:20
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zx1984

木虫 (正式写手)
★
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-07-11 20:14:00
我用pet28a载体表达蛋白，也用超声破碎和和先溶菌酶处理后超声处理破碎，和你一样的情况，也是不挂镍柱。后来用wash buffer浓度梯度洗也不好。很郁闷。
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2楼2011-07-11 19:13:05
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

yanhui8558(金币+1): 2011-07-12 09:35:27
确定纯化条件没有问题的条件下，考虑换一下6His的位置吧，把原来 的N端换到C端！！
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3楼2011-07-12 03:21:44
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ybs007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 2011-07-14 12:40:55
yanhui8558(金币+1): 2011-07-14 17:01:43
很有可能是你融合的蛋白改变了构象，将6His包裹起来不能与镍柱亲和。由于你用的是pET-21a，貌似只有C端的6His，所以要么更换载体，或者更换其他的纯化标签，比如T7标签。
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平生我自知
4楼2011-07-14 10:27:08
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