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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因克隆
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yanjing2001

银虫 (小有名气)

[交流] 基因克隆 已有3人参与

我做的是截短启动子片段（1.5kk～0.2kb）和pGL4.10连接：先做了TA克隆，测序正确后，提质粒双酶切后和载体片段连接，我试过了7：1和14：1进行连接，用的是takara的solution 1连接kit 16度连接16小时。目的片段双酶切和载体都没有问题，遇到的问题是转化后总是没有菌生长，希望不吝指导！非常感谢
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1楼 2011-07-11 09:00:29
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yesucao

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
感受态？？抗生素及其浓度？？还有就是你的载体1微升是不是太少了啊？？做转化的时候是不是42°热激？？不能高于42°？？？
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4楼2011-07-11 21:20:59
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
看天(金币+2): 鼓励交流 2011-07-11 16:27:33
你确定感受态没问题吗？还有体系，我一般是载体和目的片段solution 1分别是4:1:5。10ul体系。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
3楼2011-07-11 14:29:44
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yanjing2001

银虫 (小有名气)
感谢大家的回帖帮助，我的TA克隆已经成功了，现在连目的载体失败！我用的7：1和14：1是出入片段与载体的摩尔比；抗生素Amp用100微克/ml；42度热激应该没问题；我做了转化阳性对照，感受态应该没问题！
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5楼2011-07-12 17:35:17
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yanjing2001

银虫 (小有名气)
实在是找不到原因所在，高手再帮忙分析分析
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6楼2011-07-12 17:39:02
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