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WANGZHONGAC

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 回收片段连接以后为什么变短了？在线等

PCR回收的片段3000bp，跑电泳检验过了，但是连接以后再P就变成2000了，提的质粒酶切大小也不对，请问各位大虾这是怎么回事呀？
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1楼 2011-07-08 09:52:15
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

应该是回收的片段不对吧。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
2楼2011-07-08 10:50:26
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WANGZHONGAC

至尊木虫 (正式写手)
但是回收和检测用的引物是一样的，即便片段不对也不应该出现大小不相符的情况呀？
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3楼2011-07-08 11:17:38
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
WANGZHONGAC(金币+1): 2011-07-08 15:55:01
西瓜(金币+3): 有理噢 2011-07-08 19:12:12
PCR结束后回收的片段你是连到了T载体上还是其他的载体上？
如果是连接到了T载体上，出现这种情况的可能原因是你的引物与载体的某段序列的相似度比较高，所以你做PCR验证的片段并不是你连接上去的片段。
不过根据你说的提质粒的大小和酶切验证都不对，我猜测你连的应该不是T载体，如果是连到其他载体上，在连接之前肯定要进行双酶切的，酶切位点没有选好，造成需要的PCR片段被切断了，或者是你选的内切酶特异性不高。你要仔细检查一下你PCR得到得片段，看看有没有容易被酶切断的位点。
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4楼2011-07-08 11:31:36
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-07-08 19:12:23
你胶回收是酶切后回收的嘛？
看看你选择的酶切位点在基因上是否存在。。。
如果不是这种情况的话，像楼主描述的回收后3000bp，而连接酶切后就只剩2000bp了。。。这不可能的。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-07-08 12:10:56
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WANGZHONGAC

至尊木虫 (正式写手)
首先，是连接到T载体上的；其次，酶切鉴定的确与我分析的大小差别比较大，3000bp的片段连接大约3000bp的T载体，酶切后应该是出现3000左右的带，但是目的带出现在2000，和PCR差不多，这是让我疑惑的一个地方，目前正在做个单酶切看质粒大小与预期是否相同！
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6楼2011-07-08 12:53:53
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 热心 2011-07-08 19:12:38
引用回帖:
Originally posted by WANGZHONGAC at 2011-07-08 12:53:53:
首先，是连接到T载体上的；其次，酶切鉴定的确与我分析的大小差别比较大，3000bp的片段连接大约3000bp的T载体，酶切后应该是出现3000左右的带，但是目的带出现在2000，和PCR差不多，这是让我疑惑的一个地方，目前 ...

最简单的方法，就是送去测序，看你插入的片段是否发生了缺失
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7楼2011-07-08 13:34:19
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