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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » WB 有内参 么有目得。why ?
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380218013

金虫 (小有名气)

[求助] WB 有内参 么有目得。why ?

小弟最近做WB遇到麻烦，请大虾解答！

30ug上样，染色膜上有蛋白，显影有内参且较好，但是没有目的，加发光液也不亮的。目的的二抗和内参的二抗是一样的，这样是不是只能是一抗的问题？（是不是一抗稀释后放冰箱时间长的原因？）


另外，这样的膜之后是否可以重新封闭，加一抗和二抗？


3Q
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好好生活，努力赚钱
1楼 2011-06-29 20:29:03
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380218013

金虫 (小有名气)
谢谢了啊  可能是二抗的滴度不够了  我用增强buffer做目的都出来了。
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好好生活，努力赚钱
5楼2011-07-01 22:31:44
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pwj

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
380218013(金币+5): 2011-06-29 21:18:14
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-06-30 02:55:29
你一抗先稀释放冰箱？  我们做的时候都是用的时候才将一抗加到脱脂奶粉里孵一抗的。还有那张膜可以重新孵二抗，然后显影，但效果好像不好（个人意见），最好重新做。
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2楼2011-06-29 20:58:06
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380218013

金虫 (小有名气)
就是相当于分装好的。么有稀释我说错了。 可以重新加二抗我知道的，效果可以的 我经常这么干的。
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好好生活，努力赚钱
3楼2011-06-29 21:18:05
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terry130

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-06-30 18:43:27
这种情况很常见，要知道你的内参都是丰度很高的蛋白，而你的目的蛋白往往是一些低丰度蛋白。就算一抗好用，有的时候如果丰度太低的话条带都是很淡的。30ug上样量还可以，你可以先尝试一次长曝光，比如1h曝光，如果还是没有目的条带的话就加大上样量再试试，当你尝试100ug+1h expose还没有条带之后，再考虑换抗体吧。
另外目的蛋白丰度低的时候做WB的时候最好把内参和目的蛋白剪开分别做，否则内参的信号太强容易干扰你的目的蛋白的曝光反应。
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摒气动方息，宁神心自明。
4楼2011-06-30 07:48:59
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