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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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380218013

金虫 (小有名气)

[求助] WB 有内参 么有目得。why ?

小弟最近做WB遇到麻烦,请大虾解答!

30ug上样,染色膜上有蛋白,显影有内参且较好,但是没有目的,加发光液也不亮的。目的的二抗和内参的二抗是一样的,这样是不是只能是一抗的问题?(是不是一抗稀释后放冰箱时间长的原因?)


另外,这样的膜之后是否可以重新封闭,加一抗和二抗?


3Q
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pwj

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
380218013(金币+5): 2011-06-29 21:18:14
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-06-30 02:55:29
你一抗先稀释放冰箱?  我们做的时候都是用的时候才将一抗加到脱脂奶粉里孵一抗的。还有那张膜可以重新孵二抗,然后显影,但效果好像不好(个人意见),最好重新做。
2楼2011-06-29 20:58:06
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380218013

金虫 (小有名气)

就是相当于分装好的。么有稀释我说错了。 可以重新加二抗我知道的,效果可以的 我经常这么干的。
好好生活,努力赚钱
3楼2011-06-29 21:18:05
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terry130

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-06-30 18:43:27
这种情况很常见,要知道你的内参都是丰度很高的蛋白,而你的目的蛋白往往是一些低丰度蛋白。就算一抗好用,有的时候如果丰度太低的话条带都是很淡的。30ug上样量还可以,你可以先尝试一次长曝光,比如1h曝光,如果还是没有目的条带的话就加大上样量再试试,当你尝试100ug+1h expose还没有条带之后,再考虑换抗体吧。
另外目的蛋白丰度低的时候做WB的时候最好把内参和目的蛋白剪开分别做,否则内参的信号太强容易干扰你的目的蛋白的曝光反应。
摒气动方息,宁神心自明。
4楼2011-06-30 07:48:59
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380218013

金虫 (小有名气)

谢谢了啊  可能是二抗的滴度不够了  我用增强buffer做目的都出来了。
好好生活,努力赚钱
5楼2011-07-01 22:31:44
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