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倔强的投手

新虫 (小有名气)

[求助] 如何设计引物，扩增目的基因的ORF？

最近要做基因克隆，扩增基因的ORF
现在已经通过软件找到该基因的CDS和ORF
mRNA：23423-24558
CDS：23423-24412
ORF：23423-24412
该基因是没有内含子的基因
我现在要以cDNA为模板
设计引物将此段基因扩增出来
从目前的情况来看，3'端得引物可能比较好设计
因为CDS后还有一段序列
而CDS的5'端前面已经没有其他的序列了
这样的话设计引物就要从第一个核苷酸开始
我用Primer 5看了一下，5‘端根本没有合适的引物
会形成比较稳定的发卡结构
我想问的是，这种情况应该如何解决，应该怎样设计引物将此段扩增出来？
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1楼 2011-06-26 18:31:47
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sfb1020

金虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 同意！ 2011-07-05 00:48:52
引用回帖:
Originally posted by 倔强的投手 at 2011-06-27 10:42:09:
哦，不是吧
看来我的确的试试了
这个是不是要用好一点的Taq酶啊？

不用，普通的tag酶就可以
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-07-04 20:59:35
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

倔强的投手(金币+2): 2011-06-27 10:41:03
碰到这种情形你只能从第一个碱基开始了，挑了个稍微好点的，引物形成发卡结构也能P出来的。
赞一下 回复此楼
2楼2011-06-26 20:03:26
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倔强的投手

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-06-26 20:03:26:
碰到这种情形你只能从第一个碱基开始了，挑了个稍微好点的，引物形成发卡结构也能P出来的。

关键形成的发卡结构的G值达到了-3.6，让我非常难办
赞一下 回复此楼
3楼2011-06-26 20:50:46
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sfb1020

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
倔强的投手(金币+2): 2011-06-27 10:41:11
西瓜(金币+3): 同意！-3.6已经很小了……一般认为-10才需要担心 2011-06-27 17:24:56
引用回帖:
Originally posted by 倔强的投手 at 2011-06-26 20:50:46:
关键形成的发卡结构的G值达到了-3.6，让我非常难办

-3.6影响不大，没有问题。我的引物有时候有-10的也能p出来
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-06-27 10:21:53
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