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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » P450酶
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

长鑫(金币+4): 金币一人一半吧，非常感谢，以后多交流啊 2011-06-07 17:00:21
缘分啊~我也是要弄P450酶，但是实在昆虫方面。由于我也是新手，所以lz的问题不能一一解答，但可以提供我的一些理解希望能帮助lz，共同学习。
1、首先p450是个庞大的酶系，编码基因也是超级因家族，所以lz必须明确自己想要弄哪个P450，以昆虫上为例，研究CYP4 CYP6 CYP9 CYP12 CYP18等基因家族的比较常见。
2、引物设计 这也是我比较头疼的地方。因为我的研究对象还没有过P450的报道，所以只能根据已经报道的在别的昆虫中的P450基因（当然是同一家族）的CDNA全长序列，进行简并引物的设计。这里面就需要对许多同一家族基因的保守序列的比对。推荐使用的软件是OLigo 6和primer premier（论坛都有的）。后者搜索功能强大，前者分析牛x，所以可以混合使用。
3、基因组测序不是一两天的事，而且经济上也可能很难承受（当然老板有钱另说）。微生物不太了解，但是昆虫方面听说要专业公司也得一年半载。。
4、NCBI确实很不错，做一般研究很有用。lz可以随便搜索一条微生物中P450的基因，然后用BLASTp可以得到很多同源的蛋白序列，对分析保守区和引物设计都很有帮助。关于它的使用可以论坛内搜索下，很多帖子。
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11楼2011-06-07 09:10:04
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weidandande

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

长鑫(金币+4): 金币一人一半，非常感谢，以后多多交流，呵呵 2011-06-07 17:00:40
个人有以下见解：
1、可以通过在NCBI上已登录的相似物种的P450的cDNA全长进行蛋白质比对后，设计兼并引物，得到片段后，通过RACE技术得到全序列。
2、ITS作为内间隔区转录时是要被剪切掉的，和P450之间没有什么相关性；
3、P450是超基因家族，要选定是哪一个家族的才能有更明确的目标；
4、微生物基因组测序对一般的实验室来说，算是耗费大的工程，但一般测序公司如华大可以进行，具体可以咨询，我们目前都在做转录组测序，要便宜的多，价格也在4万块左右；
5、引物设计不必太拘泥，我习惯用primier5.0，有时也用在线的primer 3.0（http://bioinfo.ebc.ee/mprimer3/），只要没有严重的发卡结构和严重的引物二聚体，都是可以用的。
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12楼2011-06-07 11:20:20
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长鑫

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wanghd2826 at 2011-06-07 09:10:04:
缘分啊~我也是要弄P450酶，但是实在昆虫方面。由于我也是新手，所以lz的问题不能一一解答，但可以提供我的一些理解希望能帮助lz，共同学习。
1、首先p450是个庞大的酶系，编码基因也是超级因家族，所以lz必须明确 ...

缘分啊，伙计！呵呵
我做的那种微生物也没有报道，我查了很多文献也没有提到，关于那个菌种我在NCBI上也没有查到相关的已经发表出来的序列，所以我也只能采用你所说的利用同家族的进行比对，然后设计简并引物。但是我有点郁闷的是，目前唯一跟我的菌种有这同样酶系的只有一种，但是从大类上就不同，一个是细菌一个是真菌，所以我在纳闷是不是可以按照那个P450酶的序列进行设计。
当然风险性我也考虑了，如果没有P出东西，那我觉得后面的实验设计就全泡汤了，自己很担忧！
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13楼2011-06-07 17:06:08
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长鑫

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by weidandande at 2011-06-07 11:20:20:
个人有以下见解：
1、可以通过在NCBI上已登录的相似物种的P450的cDNA全长进行蛋白质比对后，设计兼并引物，得到片段后，通过RACE技术得到全序列。
2、ITS作为内间隔区转录时是要被剪切掉的，和P450之间没有什么 ...

感谢感谢，从你的回答中我清楚了测序确实很不现实，其次，用于菌种鉴定的ITS测序也是没有任何意义的，非常感谢你啊，至于RACE技术，我不清楚，我去了解了解，还有太多要学，非常感谢你啊，以后还可以继续请教！希望你别嫌烦啊，呵呵！
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14楼2011-06-07 17:08:13
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likewind_z

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good! 2011-07-01 12:41:08
基因组测序，微生物基因组5Mb的话，国内一般送到华大基因，按精细程度不同，收费大概是3-7万，基因组DNA得自己提了寄过去。不算提DNA的时间，一般测序加组装、注释、分析整体耗时大约3个月，不排除基因组复杂的搞1年以上的也有，是少数情况。我手上有3个月就搞好的，也有2年还没搞定的，主要是基因组复杂程度决定。
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长鑫
15楼2011-06-30 19:58:07
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39l863t

铁虫 (初入文坛)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-07-01 12:41:22
建议你看一下这个网站吧
2011 David Nelson 对植物已克隆和命名的5100条CYP 450进行系统分析。http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html
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16楼2011-06-30 21:48:17
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长鑫

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 39l863t at 2011-06-30 21:48:17:
建议你看一下这个网站吧
2011 David Nelson 对植物已克隆和命名的5100条CYP 450进行系统分析。http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html

谢谢你！红花送上！
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17楼2011-07-01 09:15:44
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长鑫

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by likewind_z at 2011-06-30 19:58:07:
基因组测序，微生物基因组5Mb的话，国内一般送到华大基因，按精细程度不同，收费大概是3-7万，基因组DNA得自己提了寄过去。不算提DNA的时间，一般测序加组装、注释、分析整体耗时大约3个月，不排除基因组复杂的搞 ...

也谢谢你！呵呵，以后还要多请教！
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18楼2011-07-01 09:16:15
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