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wanghd2826

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

长鑫(金币+4): 金币一人一半吧,非常感谢,以后多交流啊 2011-06-07 17:00:21
缘分啊~我也是要弄P450酶,但是实在昆虫方面。由于我也是新手,所以lz的问题不能一一解答,但可以提供我的一些理解希望能帮助lz,共同学习。
1、首先p450是个庞大的酶系,编码基因也是超级因家族,所以lz必须明确自己想要弄哪个P450,以昆虫上为例,研究CYP4 CYP6 CYP9 CYP12 CYP18等基因家族的比较常见。
2、引物设计 这也是我比较头疼的地方。因为我的研究对象还没有过P450的报道,所以只能根据已经报道的在别的昆虫中的P450基因(当然是同一家族)的CDNA全长序列,进行简并引物的设计。这里面就需要对许多同一家族基因的保守序列的比对。推荐使用的软件是OLigo 6和primer premier(论坛都有的)。后者搜索功能强大,前者分析牛x,所以可以混合使用。
3、基因组测序不是一两天的事,而且经济上也可能很难承受(当然老板有钱另说)。微生物不太了解,但是昆虫方面听说要专业公司也得一年半载。。
4、NCBI确实很不错,做一般研究很有用。lz可以随便搜索一条微生物中P450的基因,然后用BLASTp可以得到很多同源的蛋白序列,对分析保守区和引物设计都很有帮助。关于它的使用可以论坛内搜索下,很多帖子。
11楼2011-06-07 09:10:04
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weidandande

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

长鑫(金币+4): 金币一人一半,非常感谢,以后多多交流,呵呵 2011-06-07 17:00:40
个人有以下见解:
1、可以通过在NCBI上已登录的相似物种的P450的cDNA全长进行蛋白质比对后,设计兼并引物,得到片段后,通过RACE技术得到全序列。
2、ITS作为内间隔区转录时是要被剪切掉的,和P450之间没有什么相关性;
3、P450是超基因家族,要选定是哪一个家族的才能有更明确的目标;
4、微生物基因组测序对一般的实验室来说,算是耗费大的工程,但一般测序公司如华大可以进行,具体可以咨询,我们目前都在做转录组测序,要便宜的多,价格也在4万块左右;
5、引物设计不必太拘泥,我习惯用primier5.0,有时也用在线的primer 3.0(http://bioinfo.ebc.ee/mprimer3/),只要没有严重的发卡结构和严重的引物二聚体,都是可以用的。
12楼2011-06-07 11:20:20
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长鑫

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by wanghd2826 at 2011-06-07 09:10:04:
缘分啊~我也是要弄P450酶,但是实在昆虫方面。由于我也是新手,所以lz的问题不能一一解答,但可以提供我的一些理解希望能帮助lz,共同学习。
1、首先p450是个庞大的酶系,编码基因也是超级因家族,所以lz必须明确 ...

缘分啊,伙计!呵呵
我做的那种微生物也没有报道,我查了很多文献也没有提到,关于那个菌种我在NCBI上也没有查到相关的已经发表出来的序列,所以我也只能采用你所说的利用同家族的进行比对,然后设计简并引物。但是我有点郁闷的是,目前唯一跟我的菌种有这同样酶系的只有一种,但是从大类上就不同,一个是细菌一个是真菌,所以我在纳闷是不是可以按照那个P450酶的序列进行设计。
当然风险性我也考虑了,如果没有P出东西,那我觉得后面的实验设计就全泡汤了,自己很担忧!
13楼2011-06-07 17:06:08
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长鑫

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by weidandande at 2011-06-07 11:20:20:
个人有以下见解:
1、可以通过在NCBI上已登录的相似物种的P450的cDNA全长进行蛋白质比对后,设计兼并引物,得到片段后,通过RACE技术得到全序列。
2、ITS作为内间隔区转录时是要被剪切掉的,和P450之间没有什么 ...

感谢感谢,从你的回答中我清楚了测序确实很不现实,其次,用于菌种鉴定的ITS测序也是没有任何意义的,非常感谢你啊,至于RACE技术,我不清楚,我去了解了解,还有太多要学,非常感谢你啊,以后还可以继续请教!希望你别嫌烦啊,呵呵!
14楼2011-06-07 17:08:13
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likewind_z

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good! 2011-07-01 12:41:08
基因组测序,微生物基因组5Mb的话,国内一般送到华大基因,按精细程度不同,收费大概是3-7万,基因组DNA得自己提了寄过去。不算提DNA的时间,一般测序加组装、注释、分析整体耗时大约3个月,不排除基因组复杂的搞1年以上的也有,是少数情况。我手上有3个月就搞好的,也有2年还没搞定的,主要是基因组复杂程度决定。

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15楼2011-06-30 19:58:07
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39l863t

铁虫 (初入文坛)

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-07-01 12:41:22
建议你看一下这个网站吧
2011 David Nelson 对植物已克隆和命名的5100条CYP 450进行系统分析。http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html
16楼2011-06-30 21:48:17
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长鑫

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 39l863t at 2011-06-30 21:48:17:
建议你看一下这个网站吧
2011 David Nelson 对植物已克隆和命名的5100条CYP 450进行系统分析。http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html

谢谢你!红花送上!
17楼2011-07-01 09:15:44
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长鑫

木虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by likewind_z at 2011-06-30 19:58:07:
基因组测序,微生物基因组5Mb的话,国内一般送到华大基因,按精细程度不同,收费大概是3-7万,基因组DNA得自己提了寄过去。不算提DNA的时间,一般测序加组装、注释、分析整体耗时大约3个月,不排除基因组复杂的搞 ...

也谢谢你!呵呵,以后还要多请教!
18楼2011-07-01 09:16:15
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