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biofeixue

木虫 (著名写手)

[求助] 没有polyA怎么逆转录？

我最近查了一些基因，想看看他们受环境的影响是表达多了还是少了？
结果发现这些基因的3端都没有polyA尾巴，为什么？另外如果没有polyA尾巴，我怎么逆转录？
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1楼2011-05-27 09:21:03
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
biofeixue(金币+5): 2011-05-27 09:30:18
西瓜(金币+5, EPI+1): 一般试剂盒都配有随机引物（一般是random 6 mers）和Oligo dT，楼主用随机引物做反转录就可以了。也可以自己设计基因特异的引物来反转录，跟PCR引物差不多。推荐前者。 2011-05-27 12:56:37
...，基因的话，按照其结构应该是有polyA的，可能你找的是编码区吧。
没有polya的话你可以用随机引物，或者你自己的特定引物来反转录啊
好运
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2楼2011-05-27 09:29:18
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

西瓜: 有poly A可以用Oligo dT作为反转录的引物啦。 2011-05-27 12:58:14
biofeixue(金币+2): 2011-05-28 15:03:38
你的实验目的，依我看polyA根本没意义，你就做反转录就是了，需要定量就用RT-realtime PCR
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3楼2011-05-27 12:30:56
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-05-27 19:27:06
biofeixue(金币+3): 2011-05-28 15:03:56
biofeixue(金币+1): 2011-06-07 08:17:55
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2011-05-27 12:30:56:
你的实验目的，依我看polyA根本没意义，你就做反转录就是了，需要定量就用RT-realtime PCR

没有polyA就不用oligo dT，这个实验他的目的就是想看该基因的表达，那么不用oligo dT最好，因为oligo dT是非特异性的，用来做所有mRNA的反转录有用，用来做特异基因的哪有什么意义
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4楼2011-05-27 13:58:39
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

biofeixue(金币+2): 2011-05-28 15:04:09
biofeixue(金币+1): 2011-06-07 08:18:01
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2011-05-27 13:58:39:
没有polyA就不用oligo dT，这个实验他的目的就是想看该基因的表达，那么不用oligo dT最好，因为oligo dT是非特异性的，用来做所有mRNA的反转录有用，用来做特异基因的哪有什么意义

我说的是引物，直接设计特异引物，比用oligo dT好多了
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5楼2011-05-27 13:59:29
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
dhd997(金币+2): 热心鼓励一下 2011-05-27 19:27:26
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2011-05-27 13:59:29:
我说的是引物，直接设计特异引物，比用oligo dT好多了

定量用的荧光定量PCR是用特异引物的，所以一般可以反转录出总的cDNA，这样子一份cDNA样品可以检测多个基因。定量时除了扩展目的基因，还需扩增actin、tublin等内参基因，作为样品量的校正。
如果在反转录时就用特异引物，那就浪费反转录酶啦。然后内参怎么做呢？
用特异性引物作反转录我是听说过，不过自己没做过，也许有些方面用特异性引物更好。请指教哦
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6楼2011-05-27 14:06:53
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yj507

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

biofeixue(金币+5): 2011-05-28 15:04:50
biofeixue(金币+1): 2011-06-07 08:18:06
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2011-05-27 13:58:39:
没有polyA就不用oligo dT，这个实验他的目的就是想看该基因的表达，那么不用oligo dT最好，因为oligo dT是非特异性的，用来做所有mRNA的反转录有用，用来做特异基因的哪有什么意义

顶起~
提取RNA后，直接设计该基因的特异引物和看家基因引物做RT，然后QPCR定量就可以比较表达量的差异了。oligodT或N6是对所有polyA或转录本逆转，对于这个实验更麻烦。
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7楼2011-05-27 17:12:45
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