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friya0910

新虫 (正式写手)

[求助] PCR引物设计

最近在做RT-PCR，内参出来了，可是目的片段一直都扩不到，是不是引物设计有问题啊？要做蛋白体外表达，在编码区左右设计了一对引物，并加上了酶切位点和保护碱基。
引物：Upper：5'catgccatggcatg AAT CAC CTG TGG TCA GGT TG 3'
           Lower：5'cgggatcccg G AGA TTT ACC TCA CCT TG 3'
请高手帮我看一下这对引物质量如何啊？我以55度作为退火温度进行PCR合适吗？
内参出来了是不是就说明我的RNA模板没问题啊？内参是从别人文献中找的，也不知道是什么基因，如果是rRNA的话，是不是不能说明我的总RNA中mRNA的质量啊？
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1楼 2011-05-23 13:12:36
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-05-25 10:04:00:
首先，酶切位点的保护碱基只是为了保证内切酶准确识别并切断酶切位点用的，你在网上查到的是neb网站的好多年前的建议保护碱基。
但是在实际操作中，后面的部分我们是不加保护碱基的，为什么呢，因为你的片段序列 ...

高手啊！我再弱弱的问个问题，我要做蛋白体外表达，我的上游引物是不是一定要从编码第一个氨基酸的ATC开始啊？老师给我设计的引物在ATC前面又加了一个A，然后再加的酶切位点和保护碱基，这样的话我总觉得表达的蛋白会不对，请高手指点一下啊！
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5楼2011-05-25 10:12:59
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励应助 2011-05-23 20:17:43
friya0910(金币+10): 2011-05-25 09:29:43
你这问题问的，累得半死终于发现你Upper引物的酶切位点是NcoI。
哥们，酶切位点只加前面就可以了，后面的不用加。Lower引物的酶切位点是BamHI，同样只加前面的保护碱基，后面的去掉。鄙人不才，修改你的引物如下：
Upper：5'atccatggAATCACCTGTGGTCAGGTTG 3'
Lower：5'cgcggatccGAGATTTACCTCACCTTG 3'
PCR程序如下；
95 5min
95 30s
56 30s
72 1kb/min      5cycles
95 30s
60 30s
72 1kb/min      30cycles
72 10min
4   hold
如果你坚持不想改引物，那你用以下程序试试：
95 5min
95 30s
56 30s
72 1kb/min      5cycles
95 30s
62 30s
72 1kb/min      30cycles
72 10min
4   hold
姑且一试吧，建议修改引物，好运
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2楼2011-05-23 16:41:51
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-05-23 16:41:51:
你这问题问的，累得半死终于发现你Upper引物的酶切位点是NcoI。
哥们，酶切位点只加前面就可以了，后面的不用加。Lower引物的酶切位点是BamHI，同样只加前面的保护碱基，后面的去掉。鄙人不才，修改你的引物如下 ...

您好，我的酶切位点的保护碱基是从网上找的，是左右都加的呀？还有NcoI的保护碱基是CATG，为啥可以变成AT呢？
1 ATCACTCCTC ACACCCTAAA CTCCCATTCT TACCAGCTCT CCTTCCATGG CTCGCTCCTC
61 CGCCGTCTGC TTCCTCCTCC TCCTCGCCTT CCTCATTGGC ACAGCCTCGG CA(ATCACCTG
121 TGGTCAGGTT GACTCTGACC TCACCTCCTG CCTTGGCTAT GCTAGAAAGG GCGGGGTCAT
181 CCCACCGGGC TGCTGCGCGG GTGTGAGGAC CCTTAACAAC TTAGCCAAGA CCACTCCTGA
241 TCGCCAGACT GCATGCAACT GCCTCAAGTC TCTGGTGAAC CCCAGCCTTG GCCTCAATGC
301 TGCTATCGTC GCCGGCATCC CCGGCAAGTG CGGCGTCAAC ATCCCCTACC CGATCAGCAT
361 GCAGACTGAT TGCAACAAGG TGAGGTAA)AT CTCCGTATGG AGCCTACTGC TGGTACTGCG
421 CATCTGCTGG TTTTATTATT AGTACTACTT GGTCGGAGCG GCGGGAATAA AAGACGCTTC
481 ATTCACCAAT GTTTGGTTTG TGAACCAGTT TGCGGTGTTG TAGTCTTCTG TTTCAGCTAA
541 TGATGTTACA TTTTAGACTC TCATTATCTT CGATGGTGGG GTCTGTAGCA TTGTAATAAA
601 ATTATGTTAT GTTATGAAAT TTGAGTTTTT TCCTTGGTAA AAAAAAAAAA
这是cDNA序列，括号里是我要表达的成熟蛋白，酶切位点是上面说的两个，我要做蛋白体外表达，但是这段序列前半部分CG含量高，后半部分AT含量高，我在设计引物的时候遇到了很大的麻烦，请高人指点一下小女子，本人初涉分子，真是郁闷至极啊！
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3楼2011-05-25 09:45:38
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★
1949stone(金币+2): 高手 高手 高高手 2011-05-25 11:58:06
首先，酶切位点的保护碱基只是为了保证内切酶准确识别并切断酶切位点用的，你在网上查到的是neb网站的好多年前的建议保护碱基。
但是在实际操作中，后面的部分我们是不加保护碱基的，为什么呢，因为你的片段序列就可以认为是保护碱基，而且保护碱基不是一定要严格按照neb推荐表上的碱基和数目的，我们有时候根据需要，会进行调节，比如为了平衡GC含量，会把推荐表上的AT全换成GC，或者反之。保护碱基的数目也是如此，有时候为了平衡长度也会增减碱基数目。所以你可以把保护碱基看成是你引物序列确定之后的调节系统，而并非固定数目和碱基的。
其次，内切酶发展到今天，以fermentas为代表的一批公司已经可以做出所有内切酶在同一buffer中的酶切活性都是100，所以我一般在前面加两个碱基做保护碱基，这两个碱基的数目和是什么由我的引物来决定。
最后，你说你的前半部分GC高，后半部分GC低，我看了一下，GC是有点高，而且呈M型，不存在你说的情况。所以建议按普通引物设计就好，采用TAKARA的prime star酶，用prime star的GC buffer试一下，应该效果会比较好。
好运
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4楼2011-05-25 10:04:00
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