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brightfuture01
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2楼2011-05-16 13:14:09
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beautybanana
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【答案】应助回帖
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告诉你自己配置大量提取质粒的方法：（推荐以及参考） 首先是溶液的配制： （I）：Solution I : 组分浓度 ：25mM Tris-Hcl (pH8.0），10mM EDTA， 50mM Glucose: 配制量：1 L 1M Tris-Hcl (pH8.0） 25ml 0.5M EDTA(pH8.0） 20ml 20% Glucose（1.11M）45ml dH2O 910ml 高温高压灭菌后4℃保存 ，使用前每50ml的Solution I中加入2ml的RNase A(20mg/ml) （II）Solution II:组分浓度 ：200mM NaOH,1%(W/V)SDS 配置量 500ml 10%SDS 50ml 2M NaOH 50ml 加灭菌水定容至500ml 充分混匀，室温保存（时间最好不要超过1个月） SDS容易产生气泡，不要剧烈搅拌。 （III）Solution III:组分浓度：3M KOAc，5M CH3COOH 配制量：500ml KOAc 147g CH3COOH 57.5ml 加入300ml去离子水搅拌溶解，加去离子水定容至500ml 高温高压灭菌后4℃保存。 根据自己需要的量等比例缩小配置量（Solution I,Solution II and Solution III） 质粒DNA的提取 (1) 用无菌接种环在平板上挑取单菌落，接种到5mlLB液体培养基（含 100ug/ml Amp），37℃ 220rpm振荡培养过夜。 (2) 取1.5mL培养液倒入1.5mLeppendorf管中，12000rpm离心1min。 弃尽上清，使液体流尽。 (3) 加入预冷的溶液Ⅰ100uL，漩涡振荡，悬浮菌体沉淀，冰浴5min。 (4) 加入新配制的溶液Ⅱ200uL，立即将离心管缓缓颠倒数次直到溶液变清亮，冰浴5min。 (5) 加入预冷的溶液Ⅲ150uL，温和混匀，冰浴5min。12000rpm离心10 min。 (6) 将上清移入干净的1.5 mL dorf 管中，加入等体积（约450ul）酚/氯仿（1：1），上下颠倒混匀，12000rpm离心5min。 (7) 将上层水相移入干净的1.5 mL eppendorf 离心管中，加入2.5倍体积（约 1mL）预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀后，置－20℃冰箱中20 min。 (8) 室温12000rpm离心10 min。 (9) 彻底去上清，沿管壁加1mL 70%乙醇漂洗沉淀，立即倒去上清，自然干燥。 (10) 将沉淀溶于40uL TE（含10ug/mL的RNase A）中，37℃保温30 min。 (11) 用1.0%琼脂糖凝胶电泳，检测提取情况，余下质粒于-20℃保存备 用。 根据你的需要，按比例提取大体积的菌液质粒，有5ml或是10ml或是50ml的离心管的话先离心均液，然后按体积的比例加试剂即可。应该很方便，离心时间可以减少至5min也可以，第（7）步放入－20℃冰箱中20 min可以减少至10min，总体时间大概在1h以内吧~  |
6楼2011-05-16 18:52:02
beautybanana
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【答案】应助回帖
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告诉你自己配置大量提取质粒的方法：（推荐以及参考） 首先是溶液的配制： （I）：Solution I : 组分浓度 ：25mM Tris-Hcl (pH8.0），10mM EDTA， 50mM Glucose: 配制量：1 L 1M Tris-Hcl (pH8.0） 25ml 0.5M EDTA(pH8.0） 20ml 20% Glucose（1.11M）45ml dH2O 910ml 高温高压灭菌后4℃保存 ，使用前每50ml的Solution I中加入2ml的RNase A(20mg/ml) （II）Solution II:组分浓度 ：200mM NaOH,1%(W/V)SDS 配置量 500ml 10%SDS 50ml 2M NaOH 50ml 加灭菌水定容至500ml 充分混匀，室温保存（时间最好不要超过1个月） SDS容易产生气泡，不要剧烈搅拌。 （III）Solution III:组分浓度：3M KOAc，5M CH3COOH 配制量：500ml KOAc 147g CH3COOH 57.5ml 加入300ml去离子水搅拌溶解，加去离子水定容至500ml 高温高压灭菌后4℃保存。 根据自己需要的量等比例缩小配置量（Solution I,Solution II and Solution III） 质粒DNA的提取 (1) 用无菌接种环在平板上挑取单菌落，接种到5mlLB液体培养基（含 100ug/ml Amp），37℃ 220rpm振荡培养过夜。 (2) 取1.5mL培养液倒入1.5mLeppendorf管中，12000rpm离心1min。 弃尽上清，使液体流尽。 (3) 加入预冷的溶液Ⅰ100uL，漩涡振荡，悬浮菌体沉淀，冰浴5min。 (4) 加入新配制的溶液Ⅱ200uL，立即将离心管缓缓颠倒数次直到溶液变清亮，冰浴5min。 (5) 加入预冷的溶液Ⅲ150uL，温和混匀，冰浴5min。12000rpm离心10 min。 (6) 将上清移入干净的1.5 mL dorf 管中，加入等体积（约450ul）酚/氯仿（1：1），上下颠倒混匀，12000rpm离心5min。 (7) 将上层水相移入干净的1.5 mL eppendorf 离心管中，加入2.5倍体积（约 1mL）预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀后，置－20℃冰箱中20 min。 (8) 室温12000rpm离心10 min。 (9) 彻底去上清，沿管壁加1mL 70%乙醇漂洗沉淀，立即倒去上清，自然干燥。 (10) 将沉淀溶于40uL TE（含10ug/mL的RNase A）中，37℃保温30 min。 (11) 用1.0%琼脂糖凝胶电泳，检测提取情况，余下质粒于-20℃保存备 用。 根据你的需要，按比例提取大体积的菌液质粒，有5ml或是10ml或是50ml的离心管的话先离心菌液收集菌体，然后按体积的比例加试剂即可。应该很方便，离心时间可以减少至5min也可以，第（7）步放入－20℃冰箱中20 min可以减少至10min，总体时间大概在1h以内吧~ |
7楼2011-05-16 18:54:20
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