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dingjunrong木虫 (小有名气)
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[求助]
PCR总是无法正确扩增所需片段，问题在哪？
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我要扩增的是一个属的特异性片段1900bp,本来以为引物有问题，又合了一遍，还是扩不出，郁闷啊~ 20ul体系：ddH2O 14.1ul 10×PCR Buffer 2ul dNTP 2ul 引物各0.5ul 模板0.5ul TaqE 0.4 ul PCR反应程序：95度 5min 95度 1min 55度 1min 72度 3min 72度 10min 30个循环 求高人分析 电泳图如下：从左向右：marker10000,阳性样品，空白对照。marker条带由小至大：250bp,500bp,1000bp,2000bp,.......  |
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syn1985
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6楼2011-05-17 17:55:14
【答案】应助回帖
1949stone(EPI+1): 鼓励 2011-05-11 12:41:36
dingjunrong(金币+2): 2011-11-07 09:54:42
dingjunrong(金币+2): 2011-11-07 09:54:42
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我看了你的反应体系的成分后，觉得： 1、你的模板太少；实在不行模板量用4ul都可以。 2、dNTP的浓度如果是100mM的话，用量就只要0.4ul 。 3、相信退火温度的确定，不用说了吧。不过个人认为退火温度影响不是很大。 4、如果实在不行，就再次设计引物吧？尽量找保守区设计引物。 你试一试这个反应体系吧？ 20ul体系： ddH2O 14.4ul 10×PCR Buffer 2ul dNTP 0.4ul 引物 各0.4ul 模板 2ul TaqE 0.4 ul |
2楼2011-05-11 11:05:04
lly198784
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3楼2011-05-11 11:21:45
lly198784
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4楼2011-05-11 11:24:18