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zhaoxinrui0511

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌,为什么每次涂板都是空平板没有菌落?

小弟快崩溃了,请大家帮帮忙:
目的基因经PCR扩增后(引物上分别加入:Nco I和Xba I酶切位点)和T载体相连,经测序验证序列唔错,之后从T载体上用Nco I和Xba I双酶切重新获得了目的基因(酶切产物的纯化采用宝生物的胶回收),同时将可以在大肠杆菌中复制存在的乳酸菌载体pNZ8148用Nco I和Xba I双酶切(酶切产物的纯化采用宝生物的胶回收),按载体:目的片段(1:4)连接后转化至大肠杆菌,为什么每次涂板都是空平板没有菌落?(但我直接转化pNZ8148空载体每次都可以张很多菌落)。
     小弟着急毕业,请各位大哥帮帮忙吧。
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beibei9535

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晕晕小版主~ 姑娘你好!

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【答案】应助回帖

zhaoxinrui0511(金币+3): 2011-05-05 11:56:26
引用回帖:
Originally posted by zhaoxinrui0511 at 2011-04-24 19:31:10:
什么公式呢?能告诉我吗?麻烦你了

1)        在进行克隆时,Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为:1 :2~10。Insert DNA的使用量(ng)=nmol数×660×Insert DNA的bp数。
2)        按照本实验操作进行连接后,直接进行转化时的连接液不要超过20 μl。当要转化的DNA量较大或准备进行电转化时,需对连接液进行乙醇沉淀,纯化DNA后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用核酸共沉剂(TaKaRa Code:D605A)可以提高DNA的回收率。
最好的年龄是,那一天,终于知道并且坚信自己有多好,不是虚张,不是夸浮,不是众人捧,是内心明明澈澈知道:是的,我就是这么好。
6楼2011-04-24 21:15:39
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好!

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1): 鼓励发帖应助。 2011-04-24 21:14:01
不能纯粹俺1:4计算!
要按浓度那个公式计算!
最好的年龄是,那一天,终于知道并且坚信自己有多好,不是虚张,不是夸浮,不是众人捧,是内心明明澈澈知道:是的,我就是这么好。
2楼2011-04-24 18:47:04
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zhaoxinrui0511

金虫 (小有名气)

什么公式呢?能告诉我吗?麻烦你了
3楼2011-04-24 19:31:10
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liuyuxiu

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

4楼2011-04-24 19:49:19
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