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wzc4884

金虫 (正式写手)

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[求助] 求助连接反应中的问题，谢谢!

大家好，连接反应中遇到了问题，希望大家给予帮助，谢谢！
最近一直在构建重组质粒载体，载体为PET28a，目的片段大约为500bp。因为我是在重复师长的实验，师长使用的连接条件是：NEB连接酶，22度，10min。因为我们没有定NEB连接酶，因此在开始时，我使用的连接条件是Takara T4连接酶，22度，10min。后来发现连不上，便将条件调节为16度，3个小时。可是转化涂板后发现依然没有单克隆生长。凝胶显示酶切也正常，回收片段的浓度也测定了，根据载体与目的片段1:10进行连接，可是，就是长不出单克隆。
另外，想请问：加连接体系时时需要是冰浴条件下吗？是否是在里阿杰反应中有一些该注意的细节没有注意呢？
我实在是找不出自己是哪里出现问题了，希望大家给予帮助。谢谢了！

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1楼2011-04-23 22:11:13

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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-04-25 09:49:35

额，这算小问题哈。
第一，看你的pcr产物是平末端还是粘末端。这个问题很小，但是出问题的很多。
第二，TAKARA酶就行了。NEB太贵了。TAKARA要是不放心，就4℃过夜，或者16度5个小时。我一般都是晚上做连接，4℃过夜。没出过事情。
第三，连接量按TAKARA说明书上写的计算下。
一般要是你条带亮度正好，就按5ul来问题不大的。