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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】关于测序的大问题！！！
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hkfgwww

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助】关于测序的大问题！！！

我有一个purF基因的序列在华大公司测序两次，这个片段连上T载体后前后两次测序结果不相同（有4个碱基突变，两次测序时间不同，不是同一批次的），这是什么原因呢？是测序的问题还是我实验的问题，并且这种情况经常遇见（以前的prs基因序列也有这种问题），我该如何解决呢？难道进行第三次测序？
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1楼 2011-04-10 16:02:16
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
hkfgwww(金币+2): 2011-04-10 16:43:30
楼主可以参考一下测序的峰图分析一下！
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2楼2011-04-10 16:07:33
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hkfgwww

银虫 (正式写手)
лл
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3楼2011-04-10 16:44:21
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gene001

金虫 (正式写手)
hkfgwww(金币+2): 2011-04-13 14:28:12
1、PCR产物是否同一批的？要是同一批，就应该好好分析测序结果图（峰图）！
2、四个不同碱基是否导致编码氨基酸的改变？如果没有，你用该序列应该不会有问题，要是氨基酸改变了，你真得重新测序！
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4楼2011-04-11 18:41:31
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forrestgump

新虫 (著名写手)
hkfgwww(金币+2): 2011-04-13 14:29:59
我感觉你的测序的结果可能是突变造成的。
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5楼2011-04-11 21:58:11
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)
hkfgwww(金币+1): 2011-04-13 14:29:26
多测几遍，一般华大会保存菌种一段时间的，你问下，看他们还有没有。。
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6楼2011-04-11 22:00:04
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
hkfgwww(金币+4): 2011-04-13 14:31:32
silicare(金币+2, EPI+1): 在理 2011-04-15 08:20:08
首先，关于你的克隆来源的问题。可能性之一是，本来就有不一样的。第二，（RT）PCR时用的是什么酶？taq还是别的？总的来说，千分之5左右的差异突变的概率是有的。第三，质粒或菌夜送测样品的质量。当然，最后就是测序的问题了。
如果你要找差异，那么最好保证每一步都是完美的，包括试剂。比对你的结果，是不是同义替换？多送几个样品也是一个没有办法的办法。相同克隆的，不同克隆的。
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7楼2011-04-12 01:27:36
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路人甲007

木虫 (正式写手)
hkfgwww(金币+1): 2011-04-13 14:32:08
换家公司试试嘛
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8楼2011-04-12 20:00:14
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hkfgwww

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by gene001 at 2011-04-11 18:41:31:
1、PCR产物是否同一批的？要是同一批，就应该好好分析测序结果图（峰图）！
2、四个不同碱基是否导致编码氨基酸的改变？如果没有，你用该序列应该不会有问题，要是氨基酸改变了，你真得重新测序！

1: PCR产物不是同一批，峰图已经分析没有问题。
2：四个碱基导致了四个氨基酸的突变，哎。
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9楼2011-04-13 14:29:05
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hkfgwww

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by forrestgump at 2011-04-11 21:58:11:
我感觉你的测序的结果可能是突变造成的。

是那一部分造成的突变呢？
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10楼2011-04-13 14:30:20
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hkfgwww

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 路人甲007 at 2011-04-12 20:00:14:
换家公司试试嘛

呵呵，花大基因应该不会有问题吧。
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11楼2011-04-13 14:30:44
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hkfgwww

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xujian568 at 2011-04-12 01:27:36:
首先，关于你的克隆来源的问题。可能性之一是，本来就有不一样的。第二，（RT）PCR时用的是什么酶？taq还是别的？总的来说，千分之5左右的差异突变的概率是有的。第三，质粒或菌夜送测样品的质量。当然，最后就是 ...

基因组是同一批，用的保真酶。


～～～～～～～～～～～～～～～～～～
第三，质粒或菌夜送测样品的质量

这个与样品的质量相关吗？
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12楼2011-04-13 14:33:08
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路人甲007

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hkfgwww at 2011-04-13 14:30:44:
呵呵，花大基因应该不会有问题吧。

可以换个试试  我没有说哪个公司不好
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13楼2011-04-13 16:08:08
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gene001

金虫 (正式写手)
hkfgwww(金币+1): 2011-04-14 13:38:24
引用回帖:
Originally posted by hkfgwww at 2011-04-13 14:29:05:
1: PCR产物不是同一批，峰图已经分析没有问题。
2：四个碱基导致了四个氨基酸的突变，哎。

你所比对的标准序列来源是不是和你扩增的模版来源同一个种生物？该基因在不同种属间会不会存在一些差异？
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14楼2011-04-13 19:56:14
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
hkfgwww(金币+4): 2011-04-14 13:38:13
出现这样的结果是非常正常的，一般不是测序的问题，造成这种现象的原因是：
1.在进行PCR扩增的时候，是会随机引入突变的，所以你得到的并非都是序列完全正确的片段，因此长出来的阳性克隆也并非每个都是完全正确的。
2.重组质粒在受体细胞中扩增的时候会受到受体细胞内很多酶的调控和修饰，最常见的现象是很多高度重复的片段丢失了

所以只有测序完全正确的才是你要的克隆，不正确的赶紧丢掉吧
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15楼2011-04-14 12:44:00
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hkfgwww

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-14 12:44:00:
出现这样的结果是非常正常的，一般不是测序的问题，造成这种现象的原因是：
1.在进行PCR扩增的时候，是会随机引入突变的，所以你得到的并非都是序列完全正确的片段，因此长出来的阳性克隆也并非每个都是完全正确 ...

谢谢，这个问题还真得注意。
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16楼2011-04-14 13:38:56
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zgb1982

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-14 12:44:00:
出现这样的结果是非常正常的，一般不是测序的问题，造成这种现象的原因是：
1.在进行PCR扩增的时候，是会随机引入突变的，所以你得到的并非都是序列完全正确的片段，因此长出来的阳性克隆也并非每个都是完全正确 ...

不见得完全是这样吧。要看对比的模板是不是完全相同了，我遇到过这种情况啊，三次以上的扩增比对，每次都重新提RNA反转的，结果都在相同的地方出现突变
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17楼2011-04-14 21:25:46
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zgb1982 at 2011-04-14 21:25:46:
不见得完全是这样吧。要看对比的模板是不是完全相同了，我遇到过这种情况啊，三次以上的扩增比对，每次都重新提RNA反转的，结果都在相同的地方出现突变

你所谓的比对模板就是标准序列吧，如果你练标准序列都弄错的话我也无话可说了
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18楼2011-04-15 08:43:54
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
hkfgwww(金币+1): 2011-04-25 19:30:18
这样看来，问题可能出在PCR时用的酶上，建议用高或超保真酶再扩一下。
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19楼2011-04-15 09:05:12
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