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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

[资源] 【原创】原创之六：环境样品总DNA的提取与纯化【已搜索无重复】

环境样品总DNA 的提取与纯化

无论我们是用DGGE，T‐RFLP 还是用Metagenomics 等非培养手段研究特定环境中微生物的群落演替，丰度或功能基因，首先摆在我们面前的问题是如何有效提取环境样品总DNA。环境样品总DNA 的提取关系到后续试验的成败及实验结果的可靠性。本文将结合我在metagenomic 研究过程中所积累的教训谈谈环境样品总DNA的提取、纯化及纯度检测，以加快后来人对此了解并少走些不必要的弯路。

(1) 总DNA 的提取

a 样品采集

样品的采集及保存是DNA提取的第一步，这里面最主要的我认为有以下两点：1) 避免人源污染。这个不多说，微生物无处不在。采样的器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。有兴趣的可以看看PLoSone 上面发的一篇database 中序列污染的文章：Abundant Human DNA Contamination Identified in Non‐Primate Genome Databases。2) 样品的迅速处理保存。很多时候我们的样品并非来自实验室周围，比如牛的瘤胃样品，热泉样品，重金属污染土壤样品。这个时候就涉及到样品的运输，如果有条件最好用液氮冻了运输，没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液 (多为PBS)重悬，离心收集沉淀。分装成小份，冻存于液氮或者‐80 oC 冰箱中，避免反复冻融。如果后续用间接法提取总DNA 的话，此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，这里不做详谈。

b 提取方法的选择

总DNA 的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。顾名思义，直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA；间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。

直接提取法的优缺点：直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等) 总DNA 的试验中。其最大的优点在于得率高，在某些环境样品总DNA 提取实例中，比间接提取法高数倍至数百倍。造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DNA；二是许多微生物与基质形成复杂的结构，间接提取法不易对其进行分离。在样品较珍贵时多采用此法。其缺点同样明显，所得DNA 的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得DNA 呈现黄褐色甚至黑色。说到直接提取法，不能忽视一些好的商业试剂盒 (主要用于提取土壤样品)。有一篇文章对商业试剂盒的提取效果做了对比: Comparison of five commercial DNA extraction kits for the recovery of Francisella tularensis DNA from spiked soil samples。当然这篇文章只用了三种土壤类型，有失偏颇。根据我的经验，经费充足的情况下，可以优先考虑MoBio 和Epicentre。

间接提取法的优缺点：间接提取法则既可以用来提取固相样品总DNA 也可以用来提取液体样品总DNA。在提取液体样品 (如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤的方式浓缩。与直接提取法刚好相反，其最大的优点在于提取DNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DNA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。其缺点是DNA 得率低。

c 所提DNA 完整性检测

DNA 的完整性主要采用普通琼脂糖凝胶电泳进行指示。最好采用0.8% 琼脂糖凝胶电泳，低电压长时间跑。至少要用lambda DNA/Hind III 做marker，如果在23 kb 处有一条完整或略拖尾的带，则证明DNA 完整性尚好。如有条件，可以采用脉冲场凝胶电泳对提取DNA 的完整度进行分析。用脉冲场凝胶电泳分析时，除了上面提及的那个maker，至少还应该有完整lambda DNA (约48 kb)充当另一个maker。

(2) 粗提DNA 的纯化

采用直接提取法提取的总DNA 或多或少都含有腐殖质的存在。它的存在对后续的分子生物学操作会有影响，时常会导致PCR 扩增不出来，酶切困难，连接转化率低。往往我们需要进行纯化。纯化的方法很多，但是考虑到不同实验室设施的完备性，此处我只提及四种纯化方法：胶回收，柱纯化，电泳/电洗脱，梯度离心。

a 胶回收

胶回收最大的优点在于快捷，可以在很短的时间内完成。纯化后的DNA 往往能够满足PCR 要求。但其缺点在于，膜截留式的纯化方式难免会对DNA 分子造成机械损伤，使得DNA 弥散，完整度下降。如果后续的实验室分析16S r DNA，则这种纯化方式不失为一种好方法。推荐使用QiaGen 的 40kb 大小的那款，价格小贵。

b 柱纯化

柱纯化相对于胶回收来说更为快速，十几分钟内可完成。与胶回收相比，其纯化效果要差一些。但通常情况下，纯化之后的DNA 也能够满足PCR 需求。这种方法也会造成DNA 分子的机械损伤，使得DNA 弥散，完整度下降。推荐使用Promega 的Wizard DNA clean up，同样价格小贵。

c 电泳/电洗脱

电泳/电洗脱法相对于前两种有很多优点：其一，其价格低，任何实验室都负担得起；其二，整个过程都很温和，能够保证DNA 的完整性；其三，纯化后的DNA 纯度较之前两种要好一些。但是其亦有些许不便：其一，过程耗时长，包括透析袋的准备，电洗脱，洗脱液的浓缩等；其二，DNA 损失量较前两种大，透析袋上会残留DNA。如果样品不是很珍贵，并且后续要进行Metagenomic 研究，这种方法
不失为一种好方法。如果有脉冲场凝胶电泳系统，用此方法可以得到高纯大片段
DNA，可以满足后续的metagenomic C/Fosmid 文库构建。

d 蔗糖/氯化铯密度梯度离心

如果实验室有超速离心机 (100,000g 以上)，那么这种方法无疑也是一种好方法。与电泳电洗脱法相同，这种方法在连续介质中对DNA 及杂质进行分离，可以很好的纯化DNA。纯化得到的DNA 经过低熔点凝胶电泳切胶回收，可以得到高纯度大片段的DNA，可以满足后续的metagenomic C/Fosmid 文库构建。操作简便，当然前提是有设备。

当然，除了上面几个方法之外，还有在提取过程中对样品用PVP、PVPP 缓冲液进
行洗涤或吸附的。但这种方法最后获得的DNA 纯度也仅限于能够满足PCR。这种
方法需要洗涤离心次数巨多，一提基本上一天就没了。对腐殖质特别多的样品纯
化效果不能保证。

(3) 纯化质量的检测

DNA 纯化完毕之后往往需要对纯化效果做一个初步的判断，主要包括两方面：其一，完整度判断；其二，纯度判断。

a 完整度判断

完整度判断同前所述，千万要记得的是加纯化之前的DNA 样品做对照。结果可以告诉我们纯化得率及完整度。同样，如有条件最好能跑脉冲场凝胶电泳。

b 纯度判断

纯度判断通常可以采用两种方法：分光光度计法和PCR 扩增法。分光光度计可以测定双链DNA 在260nm 处的吸收值及杂质在其他波长的吸收值。通过不同波长吸收值的比，可以对DNA 纯度做出判定。通常这种方法由于灵敏性较高，所以在存在杂质时误差较大。如果纯化方法采取的是ab 两种，那么用此方法做出的判定我个人认为可信度不高。虽然有文献对不同纯化方法做比较时选取的就是分光光度
法，但是很可能测得纯度很高，构建文库效率极低。如果纯化方法采用的是cd 两
种，那么此方法的可信度则上升一个台阶，在同等纯度指标下，DNA 可以满足后
续的文库构建，尤其是采取脉冲场电泳及氯化铯密度梯度离心时。

PCR 扩增法相对于分光光度值法有其独特的优势，因为很多实验的最终目的就是为
了PCR。如果能扩出来，则纯化的目的就达到了。但是，如果对未纯化的DNA PCR
反应进行一定的优化，在好些时候也是可以扩出目的产物的，只是出现偏好性的
可能性增大了。

码到这里，关于环境样品DNA 的提取、纯化及DNA 纯度分析基本上就结束了。我想补充的一点是，环境样品DNA 的提取方法非常之多，不同样品往往有不同的提取方法。如土壤的，粪便的，瘤胃的，污泥的都有自己的提取方法。在选择提取方法时要根据自己的实际情况考虑。但是总有一些提取方法相对来说普适性比较高，下面附上在周集中发表在AEM 文章DNA recovery from soils of diverse composition (被引1171 次). 基础上略作修改的方法 (此方法绝不仅限于提取土壤样品总DNA)：

周集中土壤DNA 直接提取法，略作修改：

(1) 从超低温冰箱中取出保存样品 (5 g)；
(2) 于室温融化；
(3) 加入13.5 mL CTAB 抽提缓冲液和50 μL 蛋白酶K 贮存液；
(4) 离心管于37oC 225 rpm 水平振荡30 min；
(5) 加入1.5 mL20%SDS；
(6) 65oC 水浴2 h，每隔15 min 轻轻颠倒数次；
(7) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，转移至一个新的50 mL 离心管中；
(8) 沉淀中再加入4.5 mL 提取液和0.5 mL 20%SDS，轻轻涡旋至混匀；
(9) 浸入液氮中冷冻3 min 后，于沸水中煮沸3 min；
(10) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，与上次上清液合并；
(11) 重复(8)、(9)、(10)一次；
(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚：氯仿(1:1 v/v) 混合，摇匀后于4 oC
12,000g 离心10 min；
(13) 将上层水相转移至一新的50 mL 离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，
混匀后于4 oC 12,000g 离心10 min；
(14) 再次转移上清至一新的离心管中，加入0.6 倍体积的异丙醇于室温沉淀1 h；
(15) 室温12,000g 离心20 min；
(16) 收集沉淀，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；
(17) 向离心管中加入1 mL TE，于4 oC 放置过夜，分装保存于‐20 oC。

实验过程中的注意事项及一些技巧：

(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔，避免剧烈震荡(试剂盒提取除外)。
(2) 用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉，避免机械剪切。
(3) 不要两两计较。酚氯仿抽提时，中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。
(4) 异丙醇沉淀时不要放在低温，0.7 倍体积室温沉淀足够了。
(5) DNA 溶解时可以放在4oC 静置过夜，次日离心取上清去除多余杂质。
(6) 水平震荡可以用那种左右晃的震荡器。
(7) 65oC 不一定非得水浴，有条件可以采用杂交炉，设置温度，转速，就不用管了。

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