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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】PCR一个月了没啥结果
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夏尔list

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】PCR一个月了没啥结果

ddH2O                           15.5
5×Buffer                            5
10毫摩尔引物                0.5/0.5
2.5mMdNTP                        2
cDNA                                  1
高保真酶prime STAR           0.5

产物1314bp，98℃     5min
                       98℃     10s
                       58℃     15s
                       72℃     1min30s   30个循环
                       4℃       hold
梯度设置了，58没错，普通taq酶有条带，但是高保真酶扩不出来，求教各位大侠。
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1楼 2011-03-26 15:36:38
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)
★
夏尔list(金币+1):谢谢参与
楼主目的带多长？
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2楼2011-03-26 15:39:12
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★ ★ ★
夏尔list(金币+1):谢谢参与
看天(金币+3): 鼓励 2011-03-27 09:16:43
这么久，变通一下啊。。。

既然taq能扩出来那就用taq扩增， 然后连载体送去测序。

如果不幸发生了点突变，那再设计引物突变回来就OK了。

不管用什么方法，做出来就是王道。。。

PS：下次再看到你的发帖我就不进来了，我对你的头像过敏。。。有点慎得慌

[ Last edited by brightfuture01 on 2011-3-26 at 15:51 ]
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3楼2011-03-26 15:48:27
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地图蜗牛

银虫 (小有名气)
★
夏尔list(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-26 15:48:27:
这么久，变通一下啊。。。

既然taq能扩出来那就用taq扩增， 然后连载体送去测序。

如果不幸发生了点突变，那再设计引物突变回来就OK了。

不管用什么方法，做出来就是王道。。。

PS：下次再看到 ...

同意，就用普通Taq酶，突变也不是那么容易就发生的。
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4楼2011-03-26 23:03:49
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wazlf

银虫 (正式写手)
★ ★
夏尔list(金币+1):谢谢参与
看天(金币+1): 鼓励回答 2011-03-27 09:16:53
楼主，你的变性温度是不是有点高？变形温度太高，酶会失活，适当降低退火温度，延长退火时间，试试看，祝楼主成功！
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5楼2011-03-26 23:19:39
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wufengjian

木虫 (正式写手)
★
夏尔list(金币+1):谢谢参与
楼主用的是cDNA啊。那样的话P不出很正常的。提RNA的原因，反转录的原因，甚至该基因有无表达，都可能是原因。
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6楼2011-03-26 23:42:28
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夏尔list

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by wufengjian at 2011-03-26 23:42:28:
楼主用的是cDNA啊。那样的话P不出很正常的。提RNA的原因，反转录的原因，甚至该基因有无表达，都可能是原因。

嗯，我用的是师姐的 cＤＮＡ，她说用actin扩过可以的，差不多大半年了，我今天又用actin扩了结果没有扩出来。我准备重新提RNA反转了，谢谢各位
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7楼2011-03-27 00:07:43
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zrr807

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
也可以再做个梯度，看下能否扩出来
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8楼2011-11-06 21:25:24
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psopsodudu

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
silicare(金币+10): 处女帖，鼓励交流 2011-11-07 13:09:36
建议cDNA还是不要放置太久，
赞一下(2人) 回复此楼
9楼2011-11-07 00:47:50
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